Выбор биодинамической химиотерапии Onco4D™ для пациентов с раком молочной железы

ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: Продемонстрированная способность MCT точно оценивать ксенотрансплантаты опухоли может сделать его надежным методом стратификации опухоли у пациентов на основе прогнозируемого ответа на терапию, что может позволить выбрать лечение на основе личных потребностей отдельного пациента. Это исследование предназначено для оценки MCT в качестве анализа для прогнозирования химиочувствительности к лечению химиотерапевтическими агентами, обычно используемыми при неоадъювантном и адъювантном лечении рака молочной железы. Если результаты этого исследования будут положительными, они послужат основой для расширенных клинических испытаний и использования МСТ при выборе терапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ: Визуализация живых клеток стала стандартом для высококонтентного анализа и приложений для разработки лекарств. Наиболее распространенные анализы живых клеток включают анализы жизнеспособности, пролиферации и цитотоксичности, поскольку клеточная физиология и функция измеряются в ответ на применяемые возмущения ксенобиотиков. Анализы жизнеспособности клеток и тканей обычно измеряют с использованием экзогенных жизненно важных красителей в качестве биомаркеров целостности мембран или клеточной метаболической активности. Однако красители инвазивны, потенциально токсичны и часто требуют фиксации ткани или пермеабилизации мембран [1, 2]. Кроме того, общий формат анализа высокого содержания и проточной цитометрии требует изолированных клеток или клеток, распределенных на плоских твердых поверхностях. В изолированных клетках отсутствуют многие биологически значимые межклеточные связи и коммуникации, которые являются отличительными чертами здоровой ткани [3, 4], а уплощенные клетки на пластинах имеют патологическую форму и анизотропные клеточные адгезии [5].

Открытие технологии, которая может предсказать ответ на терапию рака, является неотложной задачей. Несмотря на то, что существует множество технологий для оценки раннего ответа на лекарства ex vivo, все более актуальной становится необходимость проведения анализов жизнеспособности, цитотоксичности и пролиферации в трехмерных тканях или культурах [6, 7], так как ответ на лекарство в 2D часто не тот же самый. как реакция на лекарство в биологически релевантной трехмерной культуре. Отчасти это связано с тем, что геномные профили не сохраняются в монослойных культурах [8-10]. Было проведено несколько исследований, в которых отслеживалась экспрессия генов, связанных с выживанием, пролиферацией, дифференцировкой и устойчивостью клеток к терапии, которые по-разному экспрессируются в 2D-культурах по сравнению с трехмерными культурами. Например, клеточные линии эпителиального рака яичников [11, 12], гепатоцеллюлярной карциномы [13-15] или рака толстой кишки [16] демонстрируют профили экспрессии, более похожие на таковые из опухолевых тканей при измерении в трехмерной культуре, но не при выращивании в 2D. Кроме того, трехмерная среда 3D-культуры имеет другую фармакокинетику, чем 2D-монослойная культура, и приводит к различиям в чувствительности к противораковым препаратам [17-20]. Наконец, большинство современных технологий полагаются на деструктивную оценку конечной точки, что не позволяет проводить значимое лонгитюдное наблюдение за реакцией на терапию с течением времени.

Одной из основных проблем при переносе тестов на лекарственную реакцию в третье и четвертое измерения было найти средства для извлечения жизненно важной информации из глубоких (до миллиметра) внутренних тканей. Ткань полупрозрачна, и свет может распространяться диффузно на многие сантиметры. Кроме того, динамические движения живых клеток вызывают динамическое рассеяние света, вызывающее фазовые флуктуации в полях рассеянного света, которые можно измерить как динамические спеклы в диффузно отраженном от ткани свете. На этом основана спектроскопия диффузных волн (DWS) [21, 22] и диффузионно-корреляционная спектроскопия (DCS) [23-26], но этим методам не хватает разрешения по глубине. Мощным инструментом для характеристики распространения света в тканях является использование интерферометрии [27]. Интерферометрическое обнаружение лежит в основе оптической когерентной томографии (ОКТ) [28–31], которая представляет собой метод точечного сканирования, подавляющий спекл [32–34], хотя декорреляция спеклов в данных ОКТ может предоставить информацию, аналогичную той, которую предоставляет DCS. Это использовалось для измерения внутриклеточной реологии [35] и для обнаружения динамических признаков апоптоза [36]. Транспорт также может быть обнаружен с клеточным разрешением с помощью фазово-контрастной микроскопии [38], но этот подход не может быть использован в толстых тканях.

Доктор Нолти и его коллеги разработали тканевую динамическую визуализацию с объемным разрешением, в которой используются преимущества селективности по глубине низкокогерентной интерферометрии в сочетании с высоким контрастом спеклов в цифровой голографии с широким освещением. Этот метод называется контрастной томографией подвижности (MCT) и использует низкокогерентную цифровую голографию для проникновения до 1 миллиметра в живую ткань для измерения динамики спеклов от рассеяния света от динамического движения в живых клетках [37]. Ранее он применялся в качестве анализа цитотоксичности для изучения эффективности антимитотических препаратов [40]. По сути, технология работает путем профилирования «движения» клеточных органелл. Специфические изменения в движении органелл обнаруживаются очень рано в клетках, подвергающихся лечению химиотерапией, и могут быть использованы в качестве раннего предиктора ответа на химиотерапию.

MCT основан на оптической когерентной визуализации (OCI) [38]. OCI — это полнопольная короткокогерентная голография [39], которая собирает обратно рассеянные спеклы. С помощью когерентного стробирования OCI может оптически делать срезы ткани глубиной до 1 мм. MCT специально использует внутриклеточное движение в качестве эндогенного контраста для характеристики субмикронного субклеточного движения внутри трехмерной живой ткани [42].

На рис. 1 показан принцип голографической записи МСТ. После калибровки короткий когерентный свет сначала разделяется на объектный пучок и опорный пучок. Объектный пучок попадает на образец живой ткани, и линза L1 собирает отраженные от ткани спеклы. Образец живой ткани находится в фокальной плоскости линзы L1, поэтому L1 также выполняет оптическое преобразование Фурье обратно рассеянного света. Устройство с зарядовой связью (ПЗС) расположено в другой фокальной плоскости L1, поэтому оно улавливает преобразованный Фурье рассеянный свет от ткани. Опорный луч управляется каскадом задержки (не показан на рисунке), чтобы отрегулировать длину пути опорного луча, чтобы выполнить согласование нулевого пути между объектным и опорным лучами. Светоделитель объединяет оба луча, и, поскольку они согласованы по нулевому пути, они интерферируют в плоскости ПЗС. Опорный пучок наклонен на 20° во внеосевой конфигурации, а расстояние между интерференционными полосами (Λ) составляет 3 пикселя (24 мкм). Размер спеклов (аспек) настроен на ширину 3 полос (70 мкм). Дополнительные сведения об экспериментальной установке можно найти в ссылке [41].

Рисунок 1. Принцип МСТ на многоклеточных опухолевых сфероидах. Биологический образец располагается в плоскости изображения линзы L1. Обратно рассеянный свет от образца преобразуется Фурье с помощью L1 и интерферирует с эталонным лучом на кристалле ПЗС. Спекл-голограмма записывается на плоскости Фурье с углом пересечения 20° с опорным лучом. Примеры: а) необработанная цифровая голограмма; б) реконструированное изображение; в) изображение MCI. O.A.: оптическая ось; ИП: плоскость изображения; L1: объектив; БС: светоделитель; ПЗС: устройство с зарядовой связью.

АНАЛИЗ ХЕМОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РАКА EX VIVO МСТ ранее применяли для изучения эффективности антимитотических препаратов с использованием многоклеточных опухолевых сфероидов [40]. При применении МСТ к опухолевым ксенотрансплантатам он также способен демонстрировать значительно различающийся ответ между двумя клеточными линиями при воздействии цисплатина. После применения препарата значение нормализованного стандартного отклонения (НСД) чувствительной к платине клеточной линии (А2780) падает с 0,7 до 0,1 через 8 часов. Напротив, значение NSD устойчивой к платине клеточной линии (A2780-CP70) остается почти постоянным (от 0,81 до 0,80) через 9 часов после применения препарата. Значение NSD нормальной ткани мыши, прикрепленной к ксенотрансплантату опухоли, снижается лишь немного (от 0,6 до 0,52) по сравнению с A2780. На рис. 2 показаны кривые реакции на цисплатин. Значение NSD каждой точки усредняется по всей цели. Время между измерениями составляет 24 минуты для A2780-CP70 и нормальной ткани мыши и 12 минут для A2780. 20 мкМ цисплатина применяли в момент времени t = 0, и измерения продолжались 9 часов для A2780-CP70 и нормальной ткани мыши и 8 часов для A2780. При времени = 0 агрессивная клеточная линия A2780-CP70 имеет самый высокий NSD, а нормальная ткань брыжейки мыши имеет самый низкий NSD (0,6). NSD чувствительной к платине клеточной линии A2780 находится в середине: 0,7. После применения цисплатина кривая NSD для A2780 сразу падает. Значение NSD у A2780-CP70 практически не меняется.

Рис. 2. Показатель подвижности (NSD) ксенотрансплантатов опухоли рака яичников, отвечающих на 20 мкМ цисплатина. По оси X отложено время (минуты), по оси Y отложено значение NSD. Чувствительной опухолью является A2780, а нечувствительной опухолью A2780-CP70. Обе опухолевые ткани начинают с более высокой подвижностью, чем нормальная ткань мыши. Цисплатин добавляли в момент времени t=0. NSD A2780 падал очень быстро и через 8 часов снизился до 0,1. NSD нечувствительной опухоли A2780-CP70 не изменялся в течение 9-часового периода. NSD нормальной ткани мыши немного снизился по сравнению с A2780.

В дальнейшем исследовании в ветеринарных клинических условиях МСТ использовалась для прогнозирования исхода у пациентов с неходжкинской лимфомой собак. Неходжкинские лимфомы собак изначально характеризуются опухолевой инфильтрацией периферических лимфатических узлов. Неходжкинские лимфомы собак различаются по своей клинической агрессивности и реакции на химиотерапию. Единственным современным биомаркером химиореактивности является иммунофенотип опухолевых клеток (т. Т-клеточное и В-клеточное происхождение), но химиореактивность сильно различается в пределах иммунофенотипа, что снижает клиническую полезность этого биомаркера. В нашем исследовании мы использовали MCT для измерения гетерогенного ответа биоптатов собачьей лимфомы на стандартный доксорубицин. Биодинамические признаки чувствительности к доксорубицину ex vivo коррелировали с исходом у собак. Эти исследования впервые продемонстрировали полезность немаркированных внутриклеточных биодинамических маркеров для прогнозирования терапевтической эффективности лечения рака у собак.

КОНКРЕТНЫЕ ЦЕЛИ Основная цель исследования — изучить возможность использования МСТ в качестве анализа химиочувствительности у пациентов с раком молочной железы, получающих неоадъювантную химиотерапию, путем сравнения моделей МСТ, соответствующих ответу на химиотерапию или резистентности ex vivo к подтвержденному ответу или резистентности к химиотерапии, измеренной с помощью оценки ответа. Критерии солидных опухолей (RECIST) v1.1.

ПЕРВИЧНАЯ КОНЕЧНАЯ ТОЧКА: объективный патологический ответ, измеренный во время операции.