Výběr Onco4D(TM) biodynamické chemoterapie pro pacientky s rakovinou prsu

ODŮVODNĚNÍ STUDIE: Prokázaná schopnost MCT přesně vyhodnotit nádorové xenoimplantáty z něj může vytvořit spolehlivou techniku ​​pro stratifikaci nádoru pacienta na základě predikované odpovědi na terapii, která by mohla umožnit výběr léčby na základě osobních potřeb jednotlivého pacienta. Tato studie je navržena tak, aby vyhodnotila MCT jako test pro predikci chemosenzitivity na léčbu chemoterapeutickými látkami běžně používanými v neoadjuvantní a adjuvantní léčbě rakoviny prsu. Pokud budou pozitivní, výsledky této studie poskytnou základ pro rozšířené klinické studie a použití MCT při výběru terapie.

POZADÍ: Zobrazování živých buněk se stalo standardem pro analýzy s vysokým obsahem a aplikace pro objevování léků. Nejběžnější testy na živých buňkách zahrnují testy životaschopnosti, proliferace a cytotoxicity, protože buněčná fyziologie a funkce jsou měřeny v reakci na aplikované poruchy xenobiotik. Testy buněčné a tkáňové životaschopnosti se typicky měří pomocí exogenních vitálních barviv jako biomarkerů membránové integrity nebo buněčné metabolické aktivity. Barviva jsou však invazivní, potenciálně toxická a často vyžadují fixaci tkáně nebo permeabilizaci membrán [1, 2]. Kromě toho běžný formát analýzy s vysokým obsahem a průtokové cytometrie vyžaduje izolované buňky nebo buňky distribuované na plochých tvrdých površích. Izolované buňky postrádají mnoho biologicky relevantních mezibuněčných spojení a komunikací, které jsou charakteristickým znakem zdravé tkáně [3, 4], a zploštělé buňky na destičkách mají patologické tvary a anizotropní buněčné adheze [5].

Naléhavou prioritou je objev technologie, která dokáže předvídat reakci na léčbu rakoviny. Zatímco existuje mnoho technologií pro hodnocení časné reakce na léky ex vivo, potřeba provádět testy životaschopnosti, cytotoxicity a proliferace v trojrozměrné tkáni nebo kultuře se stává stále naléhavější [6, 7], protože odpověď na léky ve 2D často není stejná. jako odpověď na lék v biologicky relevantní trojrozměrné kultuře. Je to částečně proto, že genomové profily nejsou zachovány v jednovrstvých kulturách [8-10]. Existuje několik studií, které sledovaly expresi genů spojených s přežitím buněk, proliferací, diferenciací a rezistencí vůči terapii, které jsou ve 2D kulturách exprimovány odlišně ve srovnání s trojrozměrnou kulturou. Například buněčné linie epiteliálního karcinomu vaječníků [11, 12], hepatocelulárního karcinomu [13-15] nebo karcinomu tlustého střeva [16] vykazují profily exprese více podobné profilům z nádorových tkání při měření v trojrozměrné kultuře, ale ne při pěstování v 2D. Trojrozměrné prostředí 3D kultury navíc představuje odlišnou farmakokinetiku než 2D monovrstvá kultura a vytváří rozdíly v citlivosti na léky proti rakovině [17–20]. A konečně, většina současných technologií se spoléhá na destruktivní hodnocení koncových bodů, které brání smysluplnému dlouhodobému sledování odezvy na léčbu v průběhu času.

Jednou z hlavních výzev při migraci testů odezvy na léky do třetí a čtvrté dimenze bylo najít způsob, jak extrahovat životně důležité informace z hloubky (až milimetru) uvnitř živé tkáně. Tkáň je průsvitná a světlo se může šířit difuzně mnoho centimetrů. Kromě toho dynamické pohyby živých buněk způsobují dynamický rozptyl světla, který vytváří fázové fluktuace na polech rozptýleného světla, které lze měřit jako dynamické skvrny v difúzně odraženém světle z tkáně. To je základem difuzní vlnové spektroskopie (DWS) [21, 22] a difuzní korelační spektroskopie (DCS) [23-26], ale tyto techniky postrádají hloubkové rozlišení. Mocným nástrojem při charakterizaci šíření světla v tkáních je použití interferometrie [27]. Interferometrická detekce je základním procesem v optické koherentní tomografii (OCT) [28–31], což je technika bodového skenování, která potlačuje skvrnitost [32–34], ačkoli dekorelace skvrn v datech OCT může poskytnout podobné informace, jaké poskytuje DCS. To bylo použito k měření intracelulární reologie [35] a k nalezení dynamických signatur apoptózy [36]. Transport lze také detekovat v buněčném rozlišení pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem [38], ale tento přístup nelze použít v tlustých tkáních.

Dr. Nolte a jeho kolegové vyvinuli objemově rozlišené dynamické zobrazování tkání, které využívá výhod hloubkové selektivity z nízkokoherentní interferometrie v kombinaci s vysokým kontrastem skvrn v digitální holografii se širokým osvětlením. Technika se nazývá pohyblivá kontrastní tomografie (MCT) a využívá digitální holografii s nízkou koherencí k průniku až 1 milimetru do živé tkáně k měření dynamiky skvrnitosti z rozptylu světla z dynamického pohybu v živých buňkách [37]. Dříve se používal jako test cytotoxicity ke studiu účinnosti antimitotických léků [40]. Technologie v podstatě funguje tak, že profiluje „pohyb“ buněčných organel. Specifické změny v pohybu organel jsou detekovatelné velmi časně v buňkách, které procházejí odpovědí na chemoterapeutickou léčbu, a mohou být použitelné jako časný prediktor chemoterapeutické odpovědi.

MCT je založeno na optické koherenci zobrazování (OCI) [38]. OCI je celopolní krátkokoherenční holografie [39], která shromažďuje zpětně rozptýlené skvrnky. Pomocí koherenčního gatingu může OCI opticky řezat tkáň až do hloubky 1 mm. MCT specificky používá intracelulární pohyb jako endogenní kontrast k charakterizaci submikronového subcelulárního pohybu uvnitř trojrozměrné živé tkáně [42].

Obrázek 1 ukazuje princip holografického záznamu MCT. Po kalibraci se krátké koherenční světlo nejprve rozdělí na objektový paprsek a referenční paprsek. Paprsek předmětu dopadá na vzorek živé tkáně a zpětně rozptýlené skvrny z tkáně jsou sbírány čočkou L1. Vzorek živé tkáně se nachází v ohniskové rovině čočky L1, takže L1 také provádí optickou Fourierovu transformaci zpětně odraženého světla. Nábojově spojené zařízení (CCD) se nachází v druhé ohniskové rovině L1, takže zachycuje Fourierově transformované rozptylové světlo z tkáně. Referenční paprsek je řízen zpožďovacím stupněm (na obrázku není znázorněn), aby se nastavila délka dráhy referenčního paprsku, aby se provedla shoda nulové dráhy mezi objektem a referenčním paprskem. Dělič paprsků kombinuje oba paprsky a protože jsou přizpůsobeny nulové dráze, interferují v rovině CCD. Referenční paprsek je nakloněn o 20° v konfiguraci mimo osu a vzdálenost interferenčních proužků (Λ) je 3 pixely (24 μm). Velikost skvrn (aspec) je nastavena na šířku 3 třásní (70 μm). Další podrobnosti o experimentálním nastavení lze nalézt v odkazu [41].

Obr. 1. Princip MCT na mnohobuněčných nádorových sféroidech. Biologický vzorek se nachází v obrazové rovině čočky L1. Zpětně rozptýlené světlo ze vzorku je Fourierově transformováno L1 a interferováno s referenčním paprskem na CCD čipu. Skvrnitý hologram je zaznamenán na Fourierově rovině s úhlem 20 křížení s referenčním paprskem. Příklady a) Nezpracovaný digitální hologram; b) rekonstruovaný obraz; c) MCI obraz. O.A.: optická osa; I.P.: rovina obrazu; L1: čočka; BS: rozdělovač paprsků; CCD: nabíjecí zařízení.

EX VIVO ANALÝZA CHEMOSENZITIVITY KANCELÁŘE MCT byla dříve aplikována ke studiu účinnosti antimitotických léků pomocí mnohobuněčných nádorových sféroidů [40]. Při aplikaci MCT na nádorové xenoimplantáty je také schopen vykazovat významně odlišnou odpověď mezi dvěma buněčnými liniemi pod cisplatinou. Po aplikaci léku klesne hodnota normalizované směrodatné odchylky (NSD) buněčné linie citlivé na platinu (A2780) z 0,7 na 0,1 za 8 hodin. Naproti tomu hodnota NSD u buněčné linie rezistentní na platinu (A2780-CP70) zůstává téměř konstantní (0,81 až 0,80) 9 hodin po aplikaci léku. Hodnota NSD normální myší tkáně připojené k nádorovému xenoštěpu se ve srovnání s A2780 snižuje jen málo (0,6 až 0,52). Obr. 2 ukazuje křivky lékové odezvy cisplatiny. Hodnota NSD každého bodu je zprůměrována pro celý cíl. Doba mezi měřeními je 24 minut pro A2780-CP70 a normální myší tkáň a 12 minut pro A2780. 20 uM cisplatina byla aplikována v čase t = 0 a měření trvala 9 hodin pro A2780-CP70 a normální myší tkáň a trvala 8 hodin pro A2780. V čase = 0 má agresivní buněčná linie A2780-CP70 nejvyšší NSD a normální myší tkáň mezenteria má nejnižší NSD (0,6). NSD buněčné linie A2780 citlivé na platinu leží uprostřed: 0,7. Po aplikaci cisplatiny křivka NSD A2780 okamžitě klesá. Hodnota NSD u A2780-CP70 se téměř nemění.

Obr. 2 Metrika motility (NSD) xenoimplantátů nádoru rakoviny vaječníků reagujících na 20 uM cisplatinu. Na ose x je čas (minuta), na ose y je hodnota NSD. Citlivý tumor je A2780, zatímco necitlivý tumor A2780-CP70. Obě nádorové tkáně začínají s vyšší pohyblivostí než normální myší tkáň. V čase t=0 byla přidána cisplatina. NSD A2780 klesl velmi rychle a po 8 hodinách klesl na 0,1. NSD necitlivého nádoru A2780-CP70 se během 9hodinové periody nezměnilo. NSD normální myší tkáně ve srovnání s A2780 trochu klesla.

V další studii ve veterinárním klinickém prostředí byla MCT použita k predikci výsledku pacienta pro non-Hodgkinův lymfom u psů. Psí non-Hodgkinovy ​​lymfomy jsou zpočátku charakterizovány nádorovou infiltrací periferních lymfatických uzlin. Psí non-Hodgkinovy ​​lymfomy se liší svou klinickou agresivitou a odpovědí na chemoterapii. Jediným současným biomarkerem chemoreaktivity je imunofenotyp nádorových buněk (tj. původ T-buňky vs. B-buňka), ale chemoreaktivita se v rámci imunofenotypu ohromně liší, což snižuje klinickou využitelnost tohoto biomarkeru. V naší studii jsme použili MCT k měření heterogenní odpovědi biopsií psího lymfomu na standardní péči doxorubicin. Biodynamické znaky citlivosti na doxorubicin ex vivo byly korelovány s výsledkem psího pacienta. Tyto studie poprvé prokázaly užitečnost intracelulárních biodynamických markerů bez označení pro predikci terapeutické účinnosti pro léčbu rakoviny u psů.

SPECIFICKÉ CÍLE Primárním cílem studie je prozkoumat proveditelnost použití MCT jako chemosenzitivního testu u pacientek s rakovinou prsu, které dostávají neoadjuvantní chemoterapii, porovnáním vzorců MCT konzistentních s chemoterapeutickou odpovědí nebo rezistencí ex-vivo s potvrzenou odpovědí nebo rezistencí na chemoterapii, jak bylo měřeno pomocí hodnocení odpovědi Kritéria pro solidní nádory (RECIST) v1.1.

PRIMÁRNÍ KONCOVÝ BOD: Objektivní patologická odpověď měřená v době operace.