Selectie van Onco4D(TM) biodynamische chemotherapie voor borstkankerpatiënten

RATIONALE STUDIE: Het aangetoonde vermogen van MCT om tumorxenotransplantaten nauwkeurig te beoordelen, kan het een betrouwbare techniek maken voor tumorstratificatie van patiënten op basis van voorspelde respons op therapie, wat een behandelingsselectie mogelijk zou kunnen maken op basis van de persoonlijke behoeften van een individuele patiënt. Deze studie is opgezet om MCT te beoordelen als een assay voor het voorspellen van chemosensitiviteit voor behandeling met chemotherapie die routinematig wordt gebruikt bij de neoadjuvante en adjuvante behandeling van borstkanker. Indien positief, zullen de resultaten van deze studie de basis vormen voor uitgebreide klinische onderzoeken en het gebruik van MCT bij therapieselectie.

ACHTERGROND: Live-cell-beeldvorming is de standaard geworden voor high-content analyse en toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen. De meest gebruikelijke assays op levende cellen omvatten levensvatbaarheids-, proliferatie- en cytotoxiciteitsassays, aangezien cellulaire fysiologie en functie worden gemeten als reactie op toegepaste verstoringen van xenobiotica. Testen op cellulaire en weefsellevensvatbaarheid worden meestal gemeten met behulp van exogene vitale kleurstoffen als biomarkers van membraanintegriteit of cellulaire metabolische activiteit. Kleurstoffen zijn echter invasief, potentieel toxisch en vereisen vaak fixatie van het weefsel of permeabilisatie van de membranen [1, 2]. Bovendien vereist het gebruikelijke formaat van analyse met een hoog gehalte en flowcytometrie geïsoleerde cellen, of cellen verdeeld over vlakke harde oppervlakken. Geïsoleerde cellen missen veel van de biologisch relevante intercellulaire verbindingen en communicaties die kenmerkend zijn voor gezond weefsel [3, 4], en afgeplatte cellen op platen hebben pathologische vormen en anisotrope cellulaire verklevingen [5].

De ontdekking van technologie die de respons op kankertherapie kan voorspellen, is een dringende prioriteit. Hoewel er veel technologieën bestaan ​​om de vroege respons op geneesmiddelen ex vivo te evalueren, is de noodzaak om levensvatbaarheids-, cytotoxiciteits- en proliferatietesten uit te voeren in driedimensionale weefsels of culturen steeds urgenter geworden [6, 7], aangezien de respons op geneesmiddelen in 2D vaak niet hetzelfde is. als medicijnrespons in biologisch relevante driedimensionale cultuur. Dit komt gedeeltelijk omdat genomische profielen niet bewaard blijven in monolaagculturen [8-10]. Er zijn verschillende onderzoeken geweest die de expressie hebben gevolgd van genen die geassocieerd zijn met celoverleving, proliferatie, differentiatie en weerstand tegen therapie die anders worden uitgedrukt in 2D-culturen dan in driedimensionale cultuur. Bijvoorbeeld, cellijnen van epitheliale eierstokkanker [11, 12], hepatocellulair carcinoom [13-15] of darmkanker [16] vertonen expressieprofielen die meer lijken op die van tumorweefsel wanneer ze worden gemeten in driedimensionale kweek, maar niet wanneer ze worden gekweekt in 2D. Bovendien vertoont de driedimensionale omgeving van 3D-kweek een andere farmacokinetiek dan 2D-monolaagkweek en produceert het verschillen in de gevoeligheden voor geneesmiddelen tegen kanker [17-20]. Ten slotte vertrouwen de meeste huidige technologieën op destructieve eindpuntbeoordeling, waardoor zinvolle longitudinale observatie van therapierespons in de loop van de tijd wordt voorkomen.

Een van de belangrijkste uitdagingen bij het migreren van testen op geneesmiddelrespons naar de derde en vierde dimensie was het vinden van een manier om vitale informatie uit diep (tot een millimeter) in levend weefsel te halen. Weefsel is doorschijnend en licht kan zich vele centimeters diffuus voortplanten. Bovendien veroorzaken de dynamische bewegingen van levende cellen dynamische lichtverstrooiing die fasefluctuaties veroorzaakt op de verstrooide lichtvelden die kunnen worden gemeten als dynamische spikkels in diffuus gereflecteerd licht van weefsel. Dit is de basis van diffusiegolfspectroscopie (DWS) [21, 22] en diffusiecorrelatiespectroscopie (DCS) [23-26], maar deze technieken missen diepteresolutie. Een krachtig hulpmiddel bij de karakterisering van lichtvoortplanting in weefsels is het gebruik van interferometrie [27]. Interferometrische detectie is het onderliggende proces bij optische coherentietomografie (OCT) [28-31], een puntscantechniek die spikkels onderdrukt [32-34], hoewel spikkeldecorrelatie in OCT-gegevens vergelijkbare informatie kan opleveren als die van DCS. Dit is gebruikt om intracellulaire reologie te meten [35] en om dynamische kenmerken van apoptose te vinden [36]. Transport kan ook worden gedetecteerd met cellulaire resolutie met behulp van fasecontrastmicroscopie [38], maar deze benadering kan niet worden gebruikt in dikke weefsels.

Dr. Nolte en collega's hebben volumetrisch opgeloste weefseldynamische beeldvorming ontwikkeld die gebruikmaakt van de voordelen van diepteselectiviteit van interferometrie met lage coherentie, gecombineerd met een hoog spikkelcontrast in digitale holografie met brede verlichting. De techniek heet Motility Contrast Tomography (MCT) en maakt gebruik van digitale holografie met lage coherentie om tot 1 millimeter in levend weefsel door te dringen om spikkeldynamiek te meten door lichtverstrooiing door dynamische beweging in levende cellen [37]. Het werd eerder toegepast als een cytotoxiciteitstest om de werkzaamheid van antimitotica te bestuderen [40]. In wezen werkt de technologie door de 'beweging' van cellulaire organellen te profileren. Specifieke veranderingen in de beweging van organellen zijn zeer vroeg detecteerbaar in cellen die een respons op chemotherapiebehandeling ondergaan, en kunnen bruikbaar zijn als een vroege voorspeller van chemotherapierespons.

MCT is gebaseerd op optische coherentiebeeldvorming (OCI) [38]. OCI is een full-field holografie met korte coherentie [39] die terugverstrooide spikkels verzamelt. Met behulp van coherentiepoorten kan OCI weefsel tot 1 mm diep optisch snijden. MCT gebruikt specifiek intracellulaire beweging als het endogene contrast om submicron subcellulaire beweging in driedimensionaal levend weefsel te karakteriseren [42].

Figuur 1 toont het holografische opnameprincipe van MCT. Na kalibratie wordt het korte coherentielicht eerst verdeeld in een objectbundel en een referentiebundel. De objectstraal raakt het levende weefselmonster en terugverstrooide spikkels van het weefsel worden opgevangen door de lens L1. Het monster van levend weefsel bevindt zich in het brandpuntsvlak van lens L1, dus L1 voert ook een optische Fourier-transformatie uit van het terugverstrooide licht. Het ladingsgekoppelde apparaat (CCD) bevindt zich in het andere brandpuntsvlak van L1 en vangt dus het Fourier-getransformeerde verstrooiingslicht van het weefsel op. De referentiebundel wordt bestuurd door een vertragingstrap (niet weergegeven in de afbeelding) om de padlengte van de referentiebundel aan te passen om een ​​nul-pad-overeenkomst tussen het object en de referentiebundels uit te voeren. De bundelsplitser combineert beide bundels en omdat ze op het nulpad zijn afgestemd, interfereren ze in het CCD-vlak. De referentiestraal is 20° gekanteld in een configuratie buiten de as en de afstand tussen de interferentielijnen (Λ) is 3 pixels (24 μm). De spikkelgrootte (aspec) wordt aangepast tot 3 franjes breed (70 μm). Aanvullende details over de experimentele opstelling zijn te vinden in referentie [41].

Figuur 1. Het principe van MCT op meercellige tumorsferoïden. Het biologische monster bevindt zich in het beeldvlak van lens L1. Het terugverstrooide licht van het monster wordt Fourier-getransformeerd door L1 en interfereert met de referentiestraal op de CCD-chip. Het spikkelhologram is opgenomen op het Fourier-vlak met een 20 kruisende engel met de referentiebundel. Voorbeelden van a) Ruw digitaal hologram; b) gereconstrueerd beeld; c) MCI-afbeelding. O.A.: optische as; I.P.: beeldvlak; L1: objectief; BS: bundelsplitser; CCD: ladingsgekoppeld apparaat.

EX VIVO KANKER CHEMOSENSITIVITEITSANALYSE MCT werd eerder toegepast om de werkzaamheid van anti-mitotische geneesmiddelen te bestuderen met behulp van meercellige tumorsferoïden [40]. Wanneer MCT wordt toegepast op tumorxenotransplantaten, kan het ook een significant verschillende respons vertonen tussen twee cellijnen onder cisplatine. Na het aanbrengen van het medicijn daalt de genormaliseerde standaarddeviatie (NSD) -waarde van de platinagevoelige cellijn (A2780) van 0,7 naar 0,1 in 8 uur. Daarentegen blijft de NSD-waarde van de platina-resistente cellijn (A2780-CP70) bijna constant (0,81 tot 0,80) 9 uur na het aanbrengen van het geneesmiddel. De NSD-waarde van normaal muisweefsel dat aan het tumorxenotransplantaat is gehecht, neemt slechts weinig af (0,6 tot 0,52) in vergelijking met A2780. Fig. 2 toont de cisplatinegeneesmiddelresponscurven. De NSD-waarde van elk punt wordt gemiddeld over het gehele doel. De tijd tussen metingen is 24 minuten voor A2780-CP70 en normaal muisweefsel en is 12 minuten voor A2780. De 20 μM cisplatine werd aangebracht op tijdstip t = 0, en de metingen duurden 9 uur voor A2780-CP70 en normaal muizenweefsel, en duurden 8 uur voor A2780. Op tijdstip = 0 heeft de agressieve cellijn A2780-CP70 de hoogste NSD en het normale mesenteriumweefsel van de muis de laagste NSD (0,6). De NSD van de platinagevoelige cellijn A2780 ligt in het midden: 0,7. Na het aanbrengen van cisplatine daalt de NSD-curve van A2780 onmiddellijk. De NSD-waarde van de A2780-CP70 verandert bijna niet.

Fig. 2 Motiliteitsmetriek (NSD) van xenotransplantaten van eierstokkanker die reageren op 20 μM cisplatine. De x-as is de tijd (minuut), de y-as is de NSD-waarde. De gevoelige tumor is A2780, terwijl de ongevoelige tumor A2780-CP70 is. Beide tumorweefsels beginnen met een hogere beweeglijkheid dan normaal muizenweefsel. Het cisplatine werd toegevoegd op tijdstip t=0. De NSD van A2780 daalde zeer snel en zakte na 8 uur naar 0,1. De NSD van de ongevoelige tumor A2780-CP70 veranderde niet gedurende een periode van 9 uur. De NSD van normaal muizenweefsel daalde iets in vergelijking met de A2780.

In een ander onderzoek in een veterinaire klinische setting is MCT gebruikt om de uitkomst van de patiënt voor non-Hodgkin-lymfoom bij honden te voorspellen. Canine non-Hodgkin-lymfomen worden aanvankelijk gekenmerkt door tumorinfiltratie van perifere lymfeklieren. Canine non-Hodgkin-lymfomen zijn divers in hun klinische agressiviteit en reactie op chemotherapie. De enige huidige biomarker voor chemoresponsiviteit is het immunofenotype van de tumorcel (d.w.z. T-cel versus B-cel oorsprong), maar chemoresponsiviteit varieert enorm binnen het immunofenotype, wat de klinische bruikbaarheid van deze biomarker vermindert. In onze studie hebben we MCT gebruikt om de heterogene respons van biopten van hondenlymfoom op de standaardzorg doxorubicine te meten. De biodynamische handtekeningen van doxorubicine-responsiviteit ex vivo waren gecorreleerd met de uitkomst van de hondenpatiënt. Deze onderzoeken hebben voor het eerst het nut aangetoond van labelvrije intracellulaire biodynamische markers om de therapeutische werkzaamheid voor de behandeling van kanker bij honden te voorspellen.

SPECIFIEKE DOELSTELLINGEN Het primaire doel van de studie is het onderzoeken van de haalbaarheid van het gebruik van MCT als een chemosensitiviteitstest bij borstkankerpatiënten die neoadjuvante chemotherapie krijgen door MCT-patronen te vergelijken die consistent zijn met chemotherapierespons of resistentie ex-vivo met bevestigde respons of resistentie tegen chemotherapie zoals gemeten door responsevaluatie. Criteria in solide tumoren (RECIST) v1.1-criteria.

PRIMAIRE EINDPUNT: Objectieve pathologische respons gemeten op het moment van de operatie.