Onco4D(TM) biodinamikus kemoterápia válogatás emlőrákos betegek számára

A VIZSGÁLAT INDOKOLÁSA: Az MCT kimutatott képessége a tumorxenograftok pontos értékelésére, megbízható technikává teheti a betegek daganatos rétegződését a terápiára adott válasz alapján, amely lehetővé teszi a kezelés kiválasztását az egyes betegek személyes szükségletei alapján. Ez a tanulmány az MCT értékelésére szolgál, mint az emlőrák neoadjuváns és adjuváns kezelésében rutinszerűen alkalmazott kemoterápiás szerekkel szembeni kemoszenzitivitás előrejelzésére. Ha pozitív, akkor ennek a tanulmánynak az eredményei alapját képezik a kiterjesztett klinikai vizsgálatoknak és az MCT alkalmazásának a terápia kiválasztásában.

HÁTTÉR: Az élő sejtes képalkotás a nagy tartalmú elemzési és gyógyszerkutatási alkalmazások szabványává vált. Az élő sejteken végzett leggyakoribb vizsgálatok közé tartozik az életképesség, a proliferáció és a citotoxicitás vizsgálata, mivel a sejtfiziológiát és -funkciót mérik a xenobiotikumok alkalmazott zavaraira reagálva. A sejtes és szöveti életképességi vizsgálatokat jellemzően exogén létfontosságú színezékek segítségével mérik a membrán integritásának vagy a sejtmetabolikus aktivitásnak biomarkereként. A színezékek azonban invazívak, potenciálisan mérgezőek, és gyakran szükséges a szövet rögzítése vagy a membránok permeabilizálása [1, 2]. Ezen túlmenően a nagy tartalmú elemzés és az áramlási citometria elterjedt formátuma izolált sejteket vagy sima kemény felületeken elosztott sejteket igényel. Az izolált sejtekből hiányzik számos biológiailag releváns intercelluláris kapcsolat és kommunikáció, amelyek az egészséges szövetek jellemzői [3, 4], a lemezeken lévő lapos sejtek pedig kóros alakúak és anizotróp sejtadhéziókkal rendelkeznek [5].

A rákterápiára adott válasz előrejelzésére alkalmas technológia felfedezése sürgős prioritás. Noha számos technológia létezik a gyógyszerekre adott korai válasz ex vivo értékelésére, egyre sürgetőbbé vált életképességi, citotoxicitási és proliferációs vizsgálatok elvégzése háromdimenziós szövetekben vagy tenyészetekben [6, 7], mivel a gyógyszerre adott válasz 2D-ben gyakran nem ugyanaz. gyógyszerválaszként biológiailag releváns háromdimenziós kultúrában. Ennek részben az az oka, hogy a genomi profilok nem őrződnek meg az egyrétegű kultúrákban [8-10]. Számos tanulmány követte nyomon a sejtek túlélésével, proliferációjával, differenciálódásával és a terápiával szembeni rezisztenciával kapcsolatos gének expresszióját, amelyek a 2D tenyészetekben eltérően fejeződnek ki a háromdimenziós tenyészetekhez képest. Például az epiteliális petefészekrák [11, 12], a hepatocelluláris karcinóma [13-15] vagy a vastagbélrák [16] sejtvonalai háromdimenziós tenyészetben mérve jobban mutatnak expressziós profilokat, mint a tumorszövetekből származók, de nem, ha tenyészetben termesztik. 2D. Ezenkívül a 3D tenyészet háromdimenziós környezete eltérő farmakokinetikát mutat, mint a 2D egyrétegű tenyészet, és különbségeket okoz a rákgyógyszer-érzékenységben [17-20]. Végül a legtöbb jelenlegi technológia a destruktív végpont-értékelésen alapul, ami megakadályozza a terápiás válasz érdemi longitudinális megfigyelését az idő múlásával.

A gyógyszerválasz-vizsgálatok harmadik és negyedik dimenzióba való áttelepítésének egyik fő kihívása az volt, hogy megtalálják a létfontosságú információk kinyerését az élő szövetek mélyéből (akár egy milliméterig). A szövet áttetsző, és a fény sok centiméterig terjedhet szórt. Ezenkívül az élő sejtek dinamikus mozgása dinamikus fényszórást okoz, amely fázisingadozásokat idéz elő a szórt fénymezőkön, amely dinamikus foltként mérhető a szövetről szórt fényben. Ez az alapja a diffúziós hullámspektroszkópiának (DWS) [21, 22] és a diffúziós korrelációs spektroszkópiának (DCS) [23-26], de ezek a technikák nem rendelkeznek mélységi felbontással. A szövetekben történő fényterjedés jellemzésének hatékony eszköze az interferometria [27]. Az interferometrikus detektálás az optikai koherencia-tomográfiás (OCT) [28-31] alapfolyamata, amely egy pontszkennelési technika, amely elnyomja a foltokat [32-34], bár az OCT adatokban a foltdekorreláció hasonló információkat szolgáltathat, mint a DCS. Ezt használták az intracelluláris reológia mérésére [35] és az apoptózis dinamikus aláírásainak megtalálására [36]. A transzport sejtfelbontásban is kimutatható fáziskontrasztmikroszkóppal [38], de ez a megközelítés vastag szövetekben nem alkalmazható.

Dr. Nolte és munkatársai volumetrikus felbontású szövetdinamikus képalkotást fejlesztettek ki, amely kihasználja az alacsony koherencia interferometriából származó mélységi szelektivitás előnyeit, és a széles megvilágítású digitális holográfiában a nagy foltos kontrasztot kombinálja. A technikát Motility Contrast Tomographynak (MCT) hívják, és alacsony koherencia digitális holográfiát használ, hogy 1 milliméterig behatoljon az élő szövetbe, és mérje az élő sejtek dinamikus mozgásából származó fényszórásból származó foltok dinamikáját [37]. Korábban citotoxicitási vizsgálatként alkalmazták az antimitotikus gyógyszerek hatékonyságának tanulmányozására [40]. A technológia lényegében a sejtszervecskék „mozgásának” profilozásával működik. Az organellumok mozgásának specifikus változásai nagyon korán kimutathatók a kemoterápiás kezelésre reagáló sejtekben, és felhasználhatók a kemoterápiás válasz korai előrejelzőjeként.

Az MCT az optikai koherencia képalkotáson (OCI) alapul [38]. Az OCI egy teljes mező, rövid koherencia holográfia [39], amely összegyűjti a visszaszórt foltokat. A koherencia kapuzás segítségével az OCI akár 1 mm mély szövetet is képes optikailag metszeni. Az MCT specifikusan az intracelluláris mozgást használja endogén kontrasztként a háromdimenziós élő szöveten belüli szubmikron szubcelluláris mozgás jellemzésére [42].

Az 1. ábra az MCT holografikus rögzítési elvét mutatja be. A kalibrálás után a rövid koherencia fényt először egy tárgynyalábra és egy referenciasugárra osztják. A tárgynyaláb eléri az élő szövetmintát, és a szövetből visszaszórt foltokat az L1 lencse összegyűjti. Az élő szövetminta az L1 lencse fókuszsíkjában helyezkedik el, így az L1 a visszaszórt fény optikai Fourier-transzformációját is végrehajtja. A töltéscsatolt eszköz (CCD) az L1 másik fókuszsíkjában helyezkedik el, így rögzíti a Fourier-transzformált szórófényt a szövetből. A referencianyalábot egy késleltetési fokozat vezérli (az ábrán nem látható), hogy beállítsa a referencianyaláb úthosszát, hogy az objektum és a referencianyaláb között nulla-útvonal illeszkedjen. A nyalábosztó mindkét nyalábot egyesíti, és mivel nulla útvonalon illeszkednek, interferálnak a CCD síkjában. A referencianyaláb tengelyen kívüli konfigurációban 20°-kal meg van döntve, és az interferenciaperemek (Λ) távolsága 3 pixel (24 μm). A foltméret (aspec) 3 rojt szélesre (70 μm) van beállítva. A kísérleti elrendezéssel kapcsolatos további részletek a [41] hivatkozásban találhatók.

1. ábra. Az MCT elve többsejtű tumorszferoidokon. A biológiai minta az L1 lencse képsíkjában található. A mintából származó hátsó szórt fény Fourier-transzformációja L1-gyel történik, és interferál a CCD chip referencianyalábjával. A foltos hologramot a Fourier-síkon rögzítjük egy 20-as keresztező angyallal a referencianyalábbal. Példák a) Nyers digitális hologramra; b) rekonstruált kép; c) MCI kép. O.A.: optikai tengely; I.P.: képsík; L1: lencse; BS: sugárosztó; CCD: töltéscsatolt eszköz.

EX VIVO RÁK KEMOSZENZITIVITÁSI ELEMZÉSE Korábban az MCT-t alkalmazták az antimitotikus gyógyszerek hatékonyságának tanulmányozására multicelluláris tumorszferoidok felhasználásával [40]. Ha az MCT-t tumorxenograftokra alkalmazzuk, ciszplatin alatt is képes jelentősen eltérő választ mutatni két sejtvonal között. A gyógyszer alkalmazása után a platinaérzékeny sejtvonal (A2780) normalizált standard deviációja (NSD) 8 óra alatt 0,7-ről 0,1-re csökken. Ezzel szemben a platinarezisztens sejtvonal (A2780-CP70) NSD értéke közel állandó marad (0,81-0,80) 9 órával a gyógyszer alkalmazása után. A tumorxenografthoz kapcsolt normál egérszövet NSD értéke csak kis mértékben (0,6-0,52) csökken az A2780-hoz képest. A 2. ábra a ciszplatin gyógyszerre adott válasz görbéit mutatja. Az egyes pontok NSD-értékét a teljes célpontra átlagolják. A mérések közötti idő 24 perc az A2780-CP70 és a normál egérszövet esetében, és 12 perc az A2780 esetében. A 20 μM ciszplatint a t = 0 időpontban alkalmaztuk, és a mérések 9 órán át tartottak A2780-CP70 és normál egérszövet esetén, és 8 óráig tartottak A2780 esetében. A 0 időpontban az agresszív A2780-CP70 sejtvonal rendelkezik a legmagasabb NSD-vel, és a normál egér mesenterium szövetének a legalacsonyabb az NSD-je (0,6). A platinaérzékeny A2780 sejtvonal NSD-je középen fekszik: 0,7. A ciszplatin alkalmazása után az A2780 NSD görbéje azonnal leesik. Az A2780-CP70 NSD értéke szinte nem változik.

2. ábra: 20 μM ciszplatinra reagáló petefészekrák tumor xenograftok motilitási metrikája (NSD). Az x tengely az idő (perc), az y tengely az NSD érték. Az érzékeny daganat az A2780, míg az érzéketlen daganat az A2780-CP70. Mindkét tumorszövet nagyobb mozgékonysággal kezdődik, mint a normál egérszövet. A ciszplatint t=0 időpontban adtuk hozzá. Az A2780 NSD-je nagyon gyorsan esett, és 8 óra elteltével 0,1-re esett. Az érzéketlen A2780-CP70 tumor NSD-je nem változott a 9 órás periódus alatt. A normál egérszövet NSD-je kissé csökkent az A2780-hoz képest.

Egy további, állatorvosi klinikai környezetben végzett vizsgálatban az MCT-t használták a kutya non-Hodgkin limfóma kimenetelének előrejelzésére. A kutya non-Hodgkin limfómáit kezdetben a perifériás nyirokcsomók tumoros infiltrációja jellemzi. A kutya non-Hodgkin limfómák klinikai agresszivitása és kemoterápiára adott válasza változatos. A kemoreszponzivitás egyetlen jelenlegi biomarkere a tumorsejtek immunfenotípusa (pl. T-sejt vs. B-sejt eredet), de a kemoreszponzivitás rendkívül változó az immunfenotípuson belül, ami csökkenti ennek a biomarkernek a klinikai használhatóságát. Vizsgálatunkban MCT-t használtunk a kutya limfóma biopsziák heterogén válaszának mérésére a standard doxorubicinre. A doxorubicin érzékenység ex vivo biodinamikus szignatúrája korrelált a kutyás betegek kimenetelével. Ezek a vizsgálatok első ízben mutatták be a címkementes intracelluláris biodinamikus markerek hasznosságát a kutyák rákkezelésének terápiás hatékonyságának előrejelzésében.

KÜLÖNLEGES CÉLKITŰZÉSEK A vizsgálat elsődleges célja az MCT kemoérzékenységi vizsgálatként történő alkalmazásának megvizsgálása neoadjuváns kemoterápiában részesülő emlőrákos betegek körében, összehasonlítva a kemoterápiás válaszreakcióval vagy ex vivo rezisztenciával konzisztens MCT-mintázatokat a kemoterápiával szembeni megerősített válaszreakcióval vagy rezisztenciával, a válasz értékelésével mérve. Kritériumok szilárd daganatokban (RECIST) v1.1 kritériumok.

ELSŐDLEGES VÉGPONT: A műtét időpontjában mért objektív kóros válasz.