Wybór chemioterapii biodynamicznej Onco4D™ dla pacjentów z rakiem piersi

UZASADNIENIE BADANIA: Wykazana zdolność MCT do dokładnej oceny ksenoprzeszczepów guza może sprawić, że będzie to wiarygodna technika stratyfikacji guza pacjenta w oparciu o przewidywaną odpowiedź na terapię, co może umożliwić wybór leczenia w oparciu o osobiste potrzeby indywidualnego pacjenta. To badanie ma na celu ocenę MCT jako testu do przewidywania chemiowrażliwości na leczenie środkami chemioterapeutycznymi rutynowo stosowanymi w leczeniu neoadiuwantowym i adjuwantowym raka piersi. Jeśli wyniki będą pozytywne, wyniki tego badania będą stanowić podstawę do rozszerzonych badań klinicznych i zastosowania MCT w doborze terapii.

WSTĘP: Obrazowanie żywych komórek stało się standardem w zastosowaniach do analizy o dużej zawartości i odkrywania leków. Najczęstsze testy na żywych komórkach obejmują testy żywotności, proliferacji i cytotoksyczności, ponieważ mierzy się fizjologię i funkcję komórki w odpowiedzi na zastosowane zaburzenia ksenobiotyków. Testy żywotności komórek i tkanek są zwykle mierzone przy użyciu egzogennych barwników witalnych jako biomarkerów integralności błony lub aktywności metabolicznej komórki. Barwniki są jednak inwazyjne, potencjalnie toksyczne i często wymagają utrwalenia tkanki lub przepuszczalności błon [1, 2]. Ponadto powszechny format analizy o dużej zawartości i cytometrii przepływowej wymaga izolowanych komórek lub komórek rozmieszczonych na płaskich, twardych powierzchniach. Izolowanym komórkom brakuje wielu biologicznie istotnych połączeń i połączeń międzykomórkowych, które są cechami charakterystycznymi zdrowej tkanki [3, 4], a spłaszczone komórki na płytkach mają patologiczny kształt i anizotropowe zrosty komórkowe [5].

Pilnym priorytetem jest odkrycie technologii, która może przewidywać odpowiedź na terapię przeciwnowotworową. Chociaż istnieje wiele technologii do oceny wczesnej odpowiedzi na leki ex vivo, potrzeba wykonania testów żywotności, cytotoksyczności i proliferacji w trójwymiarowej tkance lub hodowli stała się coraz bardziej pilna [6, 7], ponieważ odpowiedź na lek w 2D często nie jest taka sama jako odpowiedź na lek w biologicznie istotnej kulturze trójwymiarowej. Dzieje się tak po części dlatego, że profile genomowe nie są zachowane w kulturach jednowarstwowych [8-10]. Przeprowadzono kilka badań, w których śledzono ekspresję genów związanych z przeżyciem komórek, proliferacją, różnicowaniem i opornością na terapię, które są wyrażane inaczej w kulturach 2D niż w kulturach trójwymiarowych. Na przykład linie komórkowe nabłonkowego raka jajnika [11, 12], raka wątrobowokomórkowego [13-15] lub raka okrężnicy [16] wykazują profile ekspresji bardziej podobne do tych z tkanek nowotworowych, gdy są mierzone w hodowli trójwymiarowej, ale nie w przypadku wzrostu w 2D. Ponadto trójwymiarowe środowisko kultury 3D ma inną farmakokinetykę niż kultura jednowarstwowa 2D i powoduje różnice we wrażliwości na leki przeciwnowotworowe [17-20]. Wreszcie, większość obecnych technologii opiera się na destrukcyjnej ocenie punktu końcowego, uniemożliwiając miarodajną długoterminową obserwację odpowiedzi na terapię w czasie.

Jednym z głównych wyzwań związanych z migracją testów odpowiedzi na lek do trzeciego i czwartego wymiaru było znalezienie sposobu na wydobycie istotnych informacji z głębokiej (do milimetra) żywej tkanki. Tkanka jest przezroczysta, a światło może rozchodzić się dyfuzyjnie na wiele centymetrów. Ponadto dynamiczne ruchy żywych komórek powodują dynamiczne rozpraszanie światła, które wytwarza fluktuacje fazowe na rozproszonych polach świetlnych, które można zmierzyć jako dynamiczną plamkę w rozproszonym świetle odbitym od tkanki. Jest to podstawa dyfuzyjnej spektroskopii falowej (DWS) [21, 22] i dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej (DCS) [23-26], ale te techniki nie mają rozdzielczości głębi. Potężnym narzędziem w charakterystyce propagacji światła w tkankach jest zastosowanie interferometrii [27]. Detekcja interferometryczna jest podstawowym procesem w optycznej tomografii koherencyjnej (OCT) [28-31], która jest techniką skanowania punktowego, która tłumi plamki [32-34], chociaż dekorelacja plamek w danych OCT może dostarczyć podobnych informacji jak DCS. Zostało to wykorzystane do pomiaru reologii wewnątrzkomórkowej [35] i znalezienia dynamicznych sygnatur apoptozy [36]. Transport można również wykryć w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym [38], ale tego podejścia nie można zastosować w grubych tkankach.

Dr Nolte i współpracownicy opracowali wolumetrycznie rozdzielcze dynamiczne obrazowanie tkanek, które wykorzystuje zalety selektywności głębi z interferometrii o niskiej koherencji, w połączeniu z wysokim kontrastem plamek w holografii cyfrowej o szerokim oświetleniu. Technika ta nosi nazwę Motility Contrast Tomography (MCT) i wykorzystuje cyfrową holografię o niskiej koherencji do penetracji do 1 milimetra w żywe tkanki w celu pomiaru dynamiki plamek z rozpraszania światła z dynamicznego ruchu w żywych komórkach [37]. Wcześniej był stosowany jako test cytotoksyczności do badania skuteczności leków antymitotycznych [40]. Zasadniczo technologia działa poprzez profilowanie „ruchu” organelli komórkowych. Specyficzne zmiany w ruchu organelli są wykrywalne bardzo wcześnie w komórkach przechodzących odpowiedź na chemioterapię i mogą być przydatne jako wczesny predyktor odpowiedzi na chemioterapię.

MCT opiera się na optycznym obrazowaniu koherentnym (OCI) [38]. OCI to pełnopolowa holografia o krótkiej koherencji [39], która zbiera rozproszone wstecznie plamki. Za pomocą bramkowania koherencji OCI może optycznie ciąć tkankę na głębokość do 1 mm. MCT w szczególności wykorzystuje ruch wewnątrzkomórkowy jako endogenny kontrast do scharakteryzowania submikronowego ruchu subkomórkowego wewnątrz trójwymiarowej żywej tkanki [42].

Rysunek 1 przedstawia holograficzną zasadę zapisu MCT. Po kalibracji krótkie światło koherencyjne jest najpierw dzielone na wiązkę obiektu i wiązkę odniesienia. Wiązka obiektu uderza w próbkę żywej tkanki, a rozproszone wstecznie plamki z tkanki są zbierane przez soczewkę L1. Próbka żywej tkanki znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej soczewki L1, więc L1 wykonuje również optyczną transformatę Fouriera światła rozproszonego wstecznie. Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) znajduje się w drugiej płaszczyźnie ogniskowej L1, więc przechwytuje rozproszone światło przekształcone przez Fouriera z tkanki. Wiązka odniesienia jest kontrolowana przez stopień opóźnienia (nie pokazany na rysunku) w celu dostosowania długości ścieżki wiązki odniesienia w celu wykonania dopasowania ścieżki zerowej między obiektem a wiązkami odniesienia. Dzielnik wiązki łączy obie wiązki, a ponieważ są one dopasowane do ścieżki zerowej, interferują na płaszczyźnie CCD. Wiązka odniesienia jest pochylona o 20° w konfiguracji pozaosiowej, a odstęp między prążkami interferencyjnymi (Λ) wynosi 3 piksele (24 μm). Wielkość plamki (aspec) jest dostosowana do szerokości 3 prążków (70 μm). Dodatkowe szczegóły dotyczące układu eksperymentalnego można znaleźć w [41].

Ryc.1. Zasada MCT na wielokomórkowych sferoidach nowotworowych. Próbka biologiczna znajduje się na płaszczyźnie obrazu soczewki L1. Światło rozproszone wstecz z próbki jest transformowane Fouriera przez L1 i interferowane z wiązką odniesienia na chipie CCD. Hologram plamkowy jest rejestrowany na płaszczyźnie Fouriera z aniołem 20 przecinającym się z wiązką odniesienia. Przykłady a) Surowy hologram cyfrowy; b) zrekonstruowany obraz; c) obraz MCI. OA: oś optyczna; IP: płaszczyzna obrazu; L1: soczewka; BS: rozdzielacz wiązki; CCD: urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym.

ANALIZA WRAŻLIWOŚCI EX VIVO NA CHEMOSENTYWNOŚĆ MCT była wcześniej stosowana do badania skuteczności leków antymitotycznych przy użyciu wielokomórkowych sferoidów nowotworowych [40]. Stosując MCT do ksenoprzeszczepów guza, jest również w stanie wykazać znacząco różną odpowiedź między dwiema liniami komórkowymi pod wpływem cisplatyny. Po podaniu leku wartość znormalizowanego odchylenia standardowego (NSD) linii komórkowej wrażliwej na platynę (A2780) spada z 0,7 do 0,1 w ciągu 8 godzin. W przeciwieństwie do tego, wartość NSD platynoopornej linii komórkowej (A2780-CP70) pozostaje prawie stała (0,81 do 0,80) 9 godzin po zastosowaniu leku. Wartość NSD normalnej tkanki mysiej przyłączonej do ksenoprzeszczepu nowotworu zmniejsza się tylko nieznacznie (0,6 do 0,52) w porównaniu z A2780. Fig. 2 przedstawia krzywe odpowiedzi na lek cisplatyny. Wartość NSD każdego punktu jest uśredniana dla całego celu. Czas między pomiarami wynosi 24 minuty dla A2780-CP70 i normalnej tkanki myszy i 12 minut dla A2780. 20 µM cisplatynę zastosowano w czasie t = 0, a pomiary trwały 9 godzin dla A2780-CP70 i normalnej tkanki myszy i trwały 8 godzin dla A2780. W czasie = 0 agresywna linia komórkowa A2780-CP70 ma najwyższe NSD, a normalna tkanka krezki myszy ma najniższe NSD (0,6). NSD linii komórek wrażliwych na platynę A2780 leży pośrodku: 0,7. Po zastosowaniu cisplatyny krzywa NSD A2780 natychmiast spada. Wartość NSD A2780-CP70 prawie się nie zmienia.

Ryc. 2 Metryka ruchliwości (NSD) ksenoprzeszczepów raka jajnika reagujących na 20 μM cisplatyny. Oś x to czas (minuty), oś y to wartość NSD. Wrażliwy guz to A2780, natomiast niewrażliwy guz A2780-CP70. Obie tkanki nowotworowe zaczynają się od większej ruchliwości niż normalna tkanka mysia. Cisplatynę dodano w czasie t=0. NSD A2780 spadł bardzo szybko i po 8 godzinach spadł do 0,1. NSD niewrażliwego guza A2780-CP70 nie zmieniło się w ciągu 9 godzin. NSD normalnej tkanki myszy spadło nieco w porównaniu z A2780.

W dalszych badaniach w weterynaryjnych warunkach klinicznych MCT zastosowano do przewidywania wyniku leczenia psiego chłoniaka nieziarniczego. Chłoniaki nieziarnicze u psów początkowo charakteryzują się naciekiem nowotworowym obwodowych węzłów chłonnych. Chłoniaki nieziarnicze psów różnią się pod względem agresywności klinicznej i odpowiedzi na chemioterapię. Jedynym obecnym biomarkerem odpowiedzi na chemioterapię jest immunofenotyp komórek nowotworowych (tj. komórki T vs. pochodzenie komórek B), ale reaktywność na chemioterapię różni się ogromnie w obrębie immunofenotypu, co zmniejsza użyteczność kliniczną tego biomarkera. W naszym badaniu wykorzystaliśmy MCT do pomiaru heterogennej odpowiedzi biopsji psiego chłoniaka na standardową doksorubicynę. Biodynamiczne sygnatury odpowiedzi na doksorubicynę ex vivo były skorelowane z wynikami pacjentów będących psami. Badania te po raz pierwszy wykazały przydatność wewnątrzkomórkowych markerów biodynamicznych bez znaczników do przewidywania skuteczności terapeutycznej w leczeniu raka u psów.

SZCZEGÓŁOWE CELE Głównym celem badania jest zbadanie możliwości zastosowania MCT jako testu wrażliwości na chemioterapię wśród pacjentów z rakiem piersi otrzymujących chemioterapię neoadjuwantową poprzez porównanie wzorców MCT zgodnych z odpowiedzią na chemioterapię lub opornością ex vivo na potwierdzoną odpowiedź lub oporność na chemioterapię, mierzoną za pomocą oceny odpowiedzi Kryteria dotyczące guzów litych (RECIST) kryteria v1.1.

PIERWOTNY PUNKT KOŃCOWY: obiektywna odpowiedź patologiczna mierzona w czasie operacji.