表观遗传工具作为 Covid19 的预后预测因子

这项观察性研究的目的是 1) 调查为什么 COVID-19 感染会导致个体不同的生物行为模式，2) 确定表观遗传机制在这里检测个体差异的作用，3) 确定这种行为的有效性临床治疗的模型和机制，并确保获得的结果是进一步治疗研究的一个步骤，4）评估在 MicroRNA 分析中获得的数据是否是预后的预测标记。 材料和方法 研究设计 这是一项观察性前瞻性队列研究。 在使用与我们研究相关的 G * power 3.1 程序进行的功效分析中，发现淋巴细胞百分比和 C 反应蛋白的效应大小为 0.57（托珠单抗对严重 COVID-19 患者的有效治疗）（alpha 概率误差 = 0.05);在样本宽度分析中，取功效值 0.80，要收集的患者总数为 105（每组 105/3 = 35）。

患者标准 本研究经 Bakırköy Dr.Sadi Konuk 培训和研究医院临床研究伦理委员会 (2011-CREC-40) 批准，并将根据赫尔辛基宣言的规定征得所有患者的知情同意。 当地伦理委员会批准号为2020/143（2011-CREC-40）。 参加本研究的患者将于 2020 年 5 月至 2020 年 9 月入住传染病和临床微生物学系以及重症监护室。 COVID 19 的诊断将取决于计算机断层扫描 (CT) 确认的肺部是否存在特定病变，和/或根据土耳其共和国卫生部诊断标准的实验室检查结果。

纳入标准 所有年龄在 18 至 65 岁之间的患者都将患有 COVID 19，并且尚未开始特定治疗。 患者的 COVID 19 诊断将基于完整的病史、彻底的临床检查、放射成像、实验室评估和 SARS-CoV-2 RT-PCR 分析。

排除标准

1. 患有慢性肺病或以前做过 AC 手术的人
2. 免疫缺陷者或癌症患者
3. 因自身免疫性疾病接受免疫抑制治疗的患者
4. 患有影响呼吸肌的神经系统疾病的人，例如张力减退。

根据纳入和排除标准，本研究将纳入 105 名患者受试者，分为三组； I 组 (n = 35) 患者为轻度患者，II 组 (n = 35) 患者为中度患者，III 组 (n = 35) 患者为重症和危重症患者。 轻度和中度病例通常被定义为没有严重肺炎或严重急性呼吸系统综合症的那些。 轻度症状是低烧（不超过 38 摄氏度）、干咳、乏力、喉咙痛、头痛、新的味觉和嗅觉丧失。 影像学正常或轻度肺炎表现，血淋巴细胞计数≥800/μl且血清CRP≤40mg/l，铁蛋白≤500ng/ml，D-二聚体≤1000ng/ml的患者将被纳入I组。中度症状发烧约 38.5-39 摄氏度、发冷、深咳、疲劳和身体酸痛、肌肉疼痛、全身不适。 影像学检查结果或血淋巴细胞计数<800/μl或血清CRP>40mg/l或铁蛋白>500ng/ml或D-二聚体>1000ng/ml的双侧弥漫性肺炎患者将被纳入II组。 严重症状是上述所有常见症状，以及呼吸急促、胸部不适、意识模糊/反应迟钝、脸/嘴唇发青、可能出现的胃肠道问题，如腹泻或恶心。 具有 ICU（重症监护病房）入院标准的患者，例如意识模糊或心动过速（> 125 / 分钟）或呼吸窘迫或呼吸急促（> 22 / 分钟）或低血压 <90/60 mmHg 或 SPO2 <93% 将被纳入该组三、 此外，中枢神经系统和心脏受累的患者将直接纳入重症病例组。

标本采集和处理 将在严格无菌条件下使用真空采血管通过清洁静脉穿刺采集约 10 毫升外周静脉血，并将 3 毫升分配到 EDTA 管中用于全血计数和 DNA 提取，3 毫升分配到另一个无菌专用管中用于提取 miRNA 的 RNA 保护管（-80 °C 保存）。 另外取4ml平面管，室温凝固后3000rpm离心10分钟，收集的血清-80℃保存，用于分析细胞因子等。具体测试。在处理的第7天，将在相同条件下采集第二个样本，最后在第21天，将采集第三个样本。

实验室研究 RNA 提取是根据 miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (cat. 不。 217204) https://www.qiagen.com/

使用实时 PCR 分析所选 miRNA 和基因的表达。 所需的套件、化学品和消耗品清单如下：

miRCURY LNA RT 试剂盒（货号：339340） miRCURY LNA miRNA PCR 检测试剂盒 (200)（货号：339306） miRCURY LNA SYBR Green PCR 试剂盒（600）（货号：339346）miRCURY LNA SYBR Green PCR 试剂盒（200）（货号货号：339345) PAXgene 血液 miRNA 试剂盒 (50)（货号：763134）miRNeasy 血清/血浆试剂盒（50）（货号：217184）PCR 管 0.2 毫升（1000）（货号：981005）TF/10UL 滤芯适用于P-10，RAC（货号：TF-10-R-S）TF/100UL 过滤嘴（货号：TF-100-R-S） TF/1000UL 通用过滤嘴（货号：TF-1000-R-S）

DNA甲基化分析所需的试剂盒和耗材：

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps（货号：D5006） ZymoResearch 人甲基化和非甲基化 DNA 组（带引物的 DNA）1 套（货号：D5014）ZymoResearch ZymoTaq qPCR Premix 200 反应（货号：E2055 ) 用于 1 个基因区域的初级合成耗材 AXYGEN 0.5ml 薄壁 PCR 管，平盖。 Clear1000（目录号：PCR-05-C）Capp 2.0ml 防煮微管。 Clear 1000（货号：MCT-200-C）Capp 10 ul Dnase，Rnase Free Bulk Pipet tips 10 rack（货号：5.030.010） Capp 200 ul Dnase，Rnase Free Bulk Pipet ucu（黄色吸头）10 架（货号：4.130.075） Capp 1000 ul Dnase，Rnase Free Bulk Pipet ucu（蓝色吸头）10 架（货号：4.130.135） Bio Molecular Systems 麦克风管和管帽 1 盒：20 架，每架 48 根管，960 根管，每管 4 条，带匹配的管帽（货号：MIC-TUBES960）。

当前工作中选择 miRNA 背后的动机因素是以下用于 miRNA 目标预测和功能分析的集成在线数据库的产物。http://microrna.osumc.edu， https://www.genecards.org。 http://www.mirdb.org/miRDB/ 使用 GeneMANIA（多重关联网络集成算法）分析 COVID 19 例中具有 ACE2、TMPRSS2、PARP、HOX1 基因的基因关联网络，以预测它们之间可能的功能相互作用（http://www. genemania.org）。