Strumenti epigenetici come predittori prognostici in Covid19

Gli obiettivi di questo studio osservazionale sono 1) indagare sul motivo per cui l'infezione da COVID-19 provoca diversi modelli comportamentali biologici negli individui, 2) determinare il ruolo dei meccanismi epigenetici qui per rilevare la differenza tra gli individui, 3) determinare l'efficacia di questo comportamento modello e meccanismi sul trattamento clinico e garantire che i risultati ottenuti siano un passo per ulteriori studi sul trattamento, 4) valutare se i dati ottenuti nell'analisi del microRNA sono un indicatore predittivo sulla prognosi. Materiali e metodi Disegno dello studio Questo è uno studio osservazionale prospettico di coorte. Nell'analisi della potenza eseguita con i programmi G * power 3.1 relativi al nostro studio, la dimensione dell'effetto per la percentuale di linfociti e la proteina C-reattiva è risultata pari a 0,57 (Effective Treatment of Severe COVID-19 Patients with Tocilizumab) (probabilità alfa di errore = 0,05); nell'analisi dell'ampiezza del campione, prendendo il valore di potenza 0,80, il numero totale di pazienti da raccogliere era 105 (105/3 = 35 per ciascun gruppo).

Criteri del paziente Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica (2011- CREC-40) presso il Bakırköy Dr.Sadi Konuk Training and Research Hospital e il consenso informato sarà ottenuto da tutti i pazienti secondo le regole della Dichiarazione di Helsinki. Il numero di approvazione del comitato etico locale è 2020/143 (2011-CREC-40). I pazienti arruolati in questo studio saranno ricoverati presso il Dipartimento di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica e il Dipartimento di Terapia Intensiva da maggio 2020 a settembre 2020. La diagnosi di COVID 19 dipenderà dalla presenza di lesioni specifiche nei polmoni confermate dalla tomografia computerizzata (TC) e/o dai risultati di laboratorio secondo i criteri diagnostici del Ministero della Salute della Repubblica Turca.

Criteri di inclusione Tutti i pazienti di età compresa tra 18 e 65 anni inclusi soffriranno di COVID 19 e il trattamento specifico non deve ancora essere iniziato. La diagnosi di COVID 19 dei pazienti si baserà su anamnesi completa, esame clinico approfondito, imaging radiologico, valutazione di laboratorio e analisi SARS-CoV-2 mediante RT-PCR.

Criteri di esclusione

1. Persone con malattie polmonari croniche o precedenti interventi chirurgici AC
2. Le persone con deficienza immunitaria o malati di cancro
3. Pazienti sottoposti a terapia immunosoppressiva per malattie autoimmuni
4. Le persone con malattie neurologiche che colpiscono i muscoli respiratori, come l'ipotonia.

Sulla base dei criteri di inclusione ed esclusione verranno inclusi in questo studio 105 soggetti pazienti, divisi in tre gruppi; i pazienti del gruppo I (n = 35) sono lievi, i pazienti del gruppo II (n = 35) sono moderati e i pazienti del gruppo III (n = 35) sono gravi e critici. I casi lievi e moderati sono generalmente definiti come quelli senza polmonite grave o sindrome respiratoria acuta grave. I sintomi lievi sono febbricola (non più di 38 gradi Celsius), tosse secca, affaticamento, mal di gola, mal di testa, nuova perdita del gusto e dell'olfatto. Pazienti con segni di polmonite normali o lievi all'imaging radiologico e conta dei linfociti nel sangue ≥800/μl e CRP sierica ≤40 mg/l, ferritina ≤500 ng/ml, D-dimero ≤1000 ng/ml saranno inclusi nel gruppo I. Sintomi moderati sono febbre di circa 38,5-39 gradi Celsius, brividi, tosse profonda, stanchezza e dolori muscolari, dolori muscolari, sensazione generale di malessere. Pazienti con riscontri radiologici di polmonite diffusa bilaterale o conta dei linfociti nel sangue <800/μl o CRP sierica>40 mg/lo ferritina>500 ng/ml o D-Dimero>1000 ng/ml saranno inclusi nel gruppo II. I sintomi gravi sono tutti i sintomi comuni sopra menzionati insieme a mancanza di respiro, fastidio al torace, confusione/mancata risposta, viso/labbra bluastre, possibili problemi gastrointestinali, come diarrea o nausea. I pazienti con criteri di ammissione in terapia intensiva (unità di terapia intensiva), come confusione o tachicardia (> 125 / min) o distress respiratorio o tachipnea (> 22 / min) o ipotensione <90/60 mmHg o SPO2 <93% saranno inclusi nel gruppo III. Inoltre, i pazienti con coinvolgimento del sistema nervoso centrale e del cuore saranno inclusi direttamente nel gruppo dei casi gravi.

Raccolta e manipolazione dei campioni Circa 10 ml di sangue venoso periferico saranno raccolti in condizioni rigorosamente asettiche mediante venopuntura pulita utilizzando provette per la raccolta del sangue sottovuoto e saranno distribuiti come 3 ml in provette EDTA per l'emocromo completo e l'estrazione del DNA, 3 ml in un altro speciale sterile Tubo protettivo dell'RNA (conservato a -80 gradi centigradi) per l'estrazione del miRNA. Inoltre, 4 ml in una provetta piana saranno lasciati coagulare a temperatura ambiente e quindi centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti e il siero raccolto sarà conservato a -80°C per essere utilizzato per l'analisi di citochine e altri test specifici. Al 7° giorno di trattamento verranno prelevati i secondi campioni nelle stesse condizioni ed infine, al 21° giorno, verranno prelevati i terzi campioni.

Indagini di laboratorio L'estrazione dell'RNA è stata effettuata secondo il kit miRNeasy Serum/Plasma Advanced (cat. NO. 217204) https://www.qiagen.com/

Le espressioni di miRNA e geni selezionati sono state analizzate mediante PCR in tempo reale. L'elenco dei kit, dei prodotti chimici e dei materiali di consumo necessari è il seguente:

miRCURY LNA RT Kit (N. cat.: 339340) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (200) (N. cat.: 339306) Kit miRCURY LNA SYBR Green PCR (600) (N. cat.: 339346) Kit miRCURY LNA SYBR Green PCR (200) (N. cat. n.: 339345) PAXgene Blood miRNA Kit (50) (Cat. n.: 763134) miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) (Cat. n.: 217184) PCR Tubes 0.2 ml (1000) (Cat. P-10,RAC (N. di cat.: TF-10-R-S) PUNTE CON FILTRO TF/100UL PER (N. di cat.: TF-100-R-S) PUNTE CON FILTRO UNIVERSALE TF /1000UL (N. di cat.: TF-1000-R-S)

Kit e materiali di consumo necessari per l'analisi della metilazione del DNA:

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps (Cat. n.: D5006) ZymoResearch Human Methylated & Non-methylated DNA Set (DNA w/ primer) 1 set (Cat. n.: D5014) ZymoResearch ZymoTaq qPCR Premix 200 Reactions (Cat. n.: E2055 ) Consumabile di sintesi primaria per 1 regione genica AXYGEN Provette per PCR a parete sottile da 0,5 ml, tappo piatto. Clear1000 (Cat no: PCR-05-C) Capp 2.0ml Microtubi a prova di bollitura. Clear 1000 (Cat n.: MCT-200-C) Capp 10 ul Dnase, Rnase Free Bulk Puntali per pipette 10 rack (Cat n.: 5.030.010) Capp 200 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (punte gialle) 10 rack (Cat no: 4.130.075) Capp 1000 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (punte blu) 10 rack (Cat no: 4.130.135) Bio Molecular Systems Microprovette e tappi 1 confezione: 20 rack da 48 provette/rack, 960 provette in strisce da 4 con tappi corrispondenti (Cat. n.: MIC-TUBES960).

L'elemento motivazionale alla base della scelta dei miRNA nel lavoro attuale è un prodotto dei seguenti database online integrati per la previsione del target del miRNA e l'analisi funzionale. http://microrna.osumc.edu, https://www.genecards.org. http://www.mirdb.org/miRDB/ Le reti di associazione genica con i geni ACE2, TMPRSS2, PARP, HOX1 nei casi di COVID 19 sono state analizzate utilizzando GeneMANIA (Multiple Association Network Integration Algorithm) per la previsione di possibili interazioni funzionali tra di loro (http://www. genemania.org).