Epigeneettiset työkalut ennakoivina ennustajina Covid19:ssä

Tämän havaintotutkimuksen tavoitteet ovat 1) tutkia, miksi COVID-19-infektio aiheuttaa erilaisia ​​biologisia käyttäytymismalleja yksilöissä, 2) määrittää epigeneettisten mekanismien rooli yksilöiden välisten erojen havaitsemisessa, 3) määrittää tämän käyttäytymisen tehokkuus. kliinisen hoidon mallia ja mekanismeja sekä varmistaa, että saadut tulokset ovat askel jatkohoitotutkimuksiin, 4) Arvioida, onko MicroRNA-analyysissä saatu data ennustava merkki ennusteelle. Materiaali ja menetelmät Tutkimuksen suunnittelu Tämä on havainnollinen prospektiivinen kohorttitutkimus. Tutkimukseemme liittyvillä G * power 3.1 -ohjelmilla tehdyssä tehoanalyysissä lymfosyyttiprosentin ja C-reaktiivisen proteiinin vaikutuskooksi todettiin 0,57 (tehokas hoito vaikealle COVID-19-potilaalle tosilitsumabilla) (alfa todennäköisyys virhe = 0,05); näytteenleveysanalyysissä tehoarvolla 0,80 kerättyjen potilaiden kokonaismäärä oli 105 (105/3 = 35 kussakin ryhmässä).

Potilaan kriteerit Tämä tutkimus on hyväksytty Bakırköyn Dr.Sadi Konukin koulutus- ja tutkimussairaalan kliinisen tutkimuksen eettisen toimikunnan (2011-CREC-40) toimesta ja kaikilta potilailta hankitaan tietoinen suostumus Helsingin julistuksen sääntöjen mukaisesti. Paikallisen eettisen toimikunnan hyväksyntänumero on 2020/143 (2011-CREC-40). Tähän tutkimukseen osallistuvat potilaat otetaan infektiotautien ja kliinisen mikrobiologian osastolle ja tehohoitoosastolle toukokuusta 2020 syyskuuhun 2020. COVID 19 -taudin diagnoosi riippuu tietokonetomografialla (CT) vahvistettujen spesifisten keuhkovaurioiden esiintymisestä ja/tai laboratoriolöydöksistä Turkin tasavallan terveysministeriön diagnostisten kriteerien mukaisesti.

Osallistumiskriteerit Kaikki mukaan lukien 18–65-vuotiaat potilaat kärsivät COVID 19:stä, eikä erityistä hoitoa pitäisi vielä aloittaa. Potilaiden COVID 19 -diagnoosi perustuu täydelliseen sairaushistoriaan, perusteelliseen kliiniseen tutkimukseen, radiologiseen kuvantamiseen, laboratorioarviointiin ja SARS-CoV-2-analyysiin RT-PCR:llä.

Poissulkemiskriteerit

1. Ihmiset, joilla on krooninen keuhkosairaus tai aiempi AC-leikkaus
2. Ihmiset, joilla on immuunipuutos tai syöpäpotilaat
3. Potilaat, jotka saavat immunosuppressiivista hoitoa autoimmuunisairauden vuoksi
4. Ihmiset, joilla on hengityslihaksiin vaikuttavia neurologisia sairauksia, kuten hypotonia.

Sisällytys- ja poissulkemiskriteerien perusteella tähän tutkimukseen otetaan mukaan 105 potilasta, jotka on jaettu kolmeen ryhmään; ryhmän I (n = 35) potilaat ovat lieviä, ryhmän II (n = 35) potilaat ovat kohtalaisia ​​ja ryhmän III (n = 35) potilaat ovat vakavia ja kriittisiä. Lievät ja kohtalaiset tapaukset määritellään yleensä sellaisiksi, joilla ei ole vaikeaa keuhkokuumetta tai vakavaa akuuttia hengitystieoireyhtymää. Lieviä oireita ovat matala kuume (enintään 38 celsiusastetta), kuiva yskä, väsymys, kurkkukipu, päänsärky, uusi maku- ja hajuaistin menetys. Potilaat, joilla on normaali tai lievä keuhkokuumelöydös radiologisessa kuvantamisessa ja veren lymfosyyttien määrä ≥800/µl ja seerumin CRP≤40 mg/l, ferritiini ≤500ng/ml, D-dimeeri ≤1000 ng/ml, sisällytetään ryhmään I. Keskivaikeat oireet ovat noin 38,5-39 astetta kuumetta, vilunväristyksiä, syvää yskää, väsymystä ja kehon kipuja, lihaskipuja, yleistä huonovointisuutta. Potilaat, joilla on bilateraalinen diffuusi keuhkokuumelöydös radiologisella kuvantamisella tai veren lymfosyyttimäärällä < 800/µl tai seerumin CRP> 40 mg/l tai ferritiinillä > 500 ng/ml tai D-dimeerillä > 1000 ng/ml, sisällytetään ryhmään II. Vakavat oireet ovat kaikki edellä mainitut yleiset oireet sekä hengenahdistus, epämukavuus rinnassa, sekavuus/reagoimattomuus, sinertävät kasvot/huulet, mahdolliset maha-suolikanavan ongelmat, kuten ripuli tai pahoinvointi. Potilaat, joilla on tehohoitoyksikön vastaanottokriteerit, kuten sekavuus tai takykardia (> 125/min) tai hengitysvaikeus tai takypnea (> 22/min) tai hypotensio <90/60 mmHg tai SPO2 <93 %, otetaan mukaan ryhmään. III. Myös potilaat, joilla on keskushermosto- ja sydänhäiriöitä, sisällytetään suoraan vakavien tapausten ryhmään.

Näytteenotto ja käsittely Noin 10 ml ääreislaskimoverta kerätään tiukoissa aseptisissa olosuhteissa puhtaalla laskimopunktiolla käyttäen tyhjiöverenkeräysputkia ja jaetaan 3 ml:na EDTA-putkiin täydellistä verenkuvaa ja DNA:n erottamista varten, 3 ml:na toisessa steriilissä erikoisessa. RNA-suojaputki (säilytetty -80 °C:ssa) miRNA:n uuttamista varten. Lisäksi tasaisessa putkessa olevan 4 ml:n annetaan hyytyä huoneenlämmössä ja sitten sentrifugoidaan 3000 rpm 10 minuuttia ja kerätty seerumi säilytetään -80 °C:ssa käytettäväksi sytokiinien ja muiden 7. hoitopäivänä otetaan toiset näytteet samoissa olosuhteissa ja lopuksi 21. päivänä otetaan kolmannet näytteet.

Laboratoriotutkimukset RNA-uutto tehtiin miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit -sarjan (cat. ei. 217204) https:// www.qiagen.com/

Valittujen miRNA:iden ja geenien ilmentymät analysoitiin käyttäen Real-Time PCR:ää. Luettelo tarvittavista sarjoista, kemikaaleista ja kulutustarvikkeista on seuraava:

miRCURY LNA RT Kit (Cat No: 339340) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (200) (Cat No: 339306) miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (600) (Cat No: 339346) miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (Cat20 SYBR Green PCR) No: 339345) PAXgene Blood miRNA Kit (50) (Cat No: 763134) miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) (Cat No: 217184) PCR-putket 0,2 ml (1000) (Cat No: 9810005) FILTER/TIULTER P-10,RAC (Cat No: TF-10-R-S) TF/100UL SUODATINKÄRJEITÄ (Cat No: TF-100-R-S) TF /1000UL YLEISSUODATINKÄRJEITÄ (Cat No: TF-1000-R-S)

DNA-metylaatioanalyysiin tarvittavat pakkaukset ja tarvikkeet:

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps (Kat.nro: D5006) ZymoResearch Ihmisen metyloitu ja metyloitumaton DNA-sarja (DNA w/alukkeilla) 1 sarja (Cat nro: D5014) ZymoResearch ZymoTaq qPCR Premix (20C5at Reactions) ) Ensisijainen synteesikulutus 1 geenialueelle AXYGEN 0,5 ml Thin Wall PCR-putket, Flat Cap. Clear1000 (Kat.nro: PCR-05-C) Korkki 2,0 ml kiehumisen kestäviä mikroputkia. Kirkas 1000 (Cat nro: MCT-200-C) Korkki 10 ul Dnase, Rnase Free Bulkki Pipetinkärjet 10 teline (Cat no: 5.030.010) Cap 200 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (keltaiset kärjet) 10 teline (Cat nro: 4.130.075) Cap 1000 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (Blue Tips) 10 teline (Cat nro: 4.130.135) Bio Molecular Systems -mikrofoniputket ja -korkit 1 Laatikko: 20 telinettä, joissa 48 putkea/teline, 960 putkea 4 kpl:n liuskoina yhteensopivalla korkilla (Cat-nro: MIC-TUBES960).

Motivaatioelementti miRNA:iden valinnan takana nykyisessä työssä on seuraavien integroitujen online-tietokantojen tuote miRNA-kohteen ennustamiseen ja toiminnalliseen analyysiin. http://micorna.osumc.edu, https://www.genecards.org. http://www.mirdb.org/miRDB/ Geeniassosiaatioverkostot ACE2-, TMPRSS2-, PARP-, HOX1-geenejä COVID 19 -tapauksissa analysoitiin käyttämällä GeneMANIAa (Multiple Association Network Integration Algorithm) niiden välisten mahdollisten toiminnallisten vuorovaikutusten ennustamiseksi (http://www. genemania.org).