Epigenetiske værktøjer som prognostiske forudsigere i Covid19

Formålet med denne observationsundersøgelse er 1) at undersøge, hvorfor COVID-19-infektion forårsager forskellige biologiske adfærdsmønstre hos individer, 2) at bestemme rollen af ​​epigenetiske mekanismer her for at opdage forskellen mellem individer, 3) at bestemme effektiviteten af ​​denne adfærd model og mekanismer på klinisk behandling og for at sikre, at de opnåede resultater er et skridt for yderligere behandlingsstudier, 4) At evaluere om data opnået i MicroRNA-analyse er en prædiktiv markør på prognose. Materiale og metoder Studiedesign Dette er et observationelt prospektivt kohortestudie. I effektanalysen udført med G * power 3.1-programmerne relateret til vores undersøgelse, blev effektstørrelsen for lymfocytprocenten og C-reaktivt protein fundet at være 0,57 (Effektiv behandling af svære COVID-19-patienter med Tocilizumab) (alfa-sandsynlighed for fejl = 0,05); i prøvebreddeanalysen var det samlede antal patienter, der skulle indsamles, 105 (105/3 = 35 for hver gruppe).

Patientkriterier Denne undersøgelse blev godkendt af Clinical Research Ethics Committee (2011- CREC-40) på Bakırköy Dr.Sadi Konuk Training and Research Hospital, og informeret samtykke vil blive indhentet fra alle patienter i henhold til reglerne i Helsinki-erklæringen. Godkendelse af det lokale etiske udvalgs nummer er 2020/143 (2011-CREC-40). Patienter, der er tilmeldt denne undersøgelse, vil blive indlagt på afdelingen for infektionssygdomme og klinisk mikrobiologi og intensivafdelingen fra maj 2020 til september 2020. Diagnose af COVID 19 vil være afhængig af tilstedeværelsen af ​​specifikke læsioner i lungerne bekræftet ved computertomografi (CT) og/eller laboratoriefund i henhold til det tyrkiske sundhedsministeriums diagnostiske kriterier.

Inklusionskriterier Alle inkluderede patienter mellem 18 og 65 år lider af COVID 19, og specifik behandling bør endnu ikke påbegyndes. COVID 19-diagnose af patienter vil være baseret på fuldstændig sygehistorie, grundig klinisk undersøgelse, radiologisk billeddannelse, laboratorievurdering og SARS-CoV-2-analyse ved RT-PCR.

Eksklusionskriterier

1. Mennesker med kronisk lungesygdom eller tidligere AC-operation
2. Mennesker med immundefekt eller kræftpatienter
3. Patienter, der modtager immunsuppressiv behandling for autoimmun sygdom
4. Mennesker med neurologiske sygdomme, der påvirker åndedrætsmusklerne, såsom hypotoni.

På basis af inklusions- og eksklusionskriterierne vil 105 patienter blive inkluderet i denne undersøgelse, opdelt i tre grupper; gruppe I (n = 35) patienter er milde, gruppe II (n = 35) patienter er moderate, og gruppe III (n = 35) patienter er alvorlige og kritiske. Milde og moderate tilfælde defineres sædvanligvis som dem uden alvorlig lungebetændelse eller alvorligt akut respiratorisk syndrom. Milde symptomer er lavgradig feber (ikke mere end 38 grader celsius), tør hoste, træthed, ondt i halsen, hovedpine, det nye tab af smag og lugt. Patienter med normale eller milde lungebetændelsesfund af radiologisk billeddannelse og blodlymfocyttal ≥800/µl og serum CRP≤40 mg/l, ferritin ≤500ng/ml, D-Dimer ≤1000 ng/ml vil blive inkluderet i gruppe I. Moderate symptomer er feber på omkring 38,5-39 grader celsius, kulderystelser, dyb hoste, træthed og smerter i kroppen, muskelsmerter, den generelle følelse af at være utilpas. Patienter med bilateral diffus lungebetændelse fund af radiologisk billeddannelse eller blodlymfocyttal <800/µl eller serum CRP> 40 mg/l eller ferritin> 500ng/ml eller D-Dimer> 1000 ng/ml vil blive inkluderet i gruppe II. Alvorlige symptomer er alle de almindelige symptomer nævnt ovenfor sammen med åndenød, ubehag i brystet, forvirring/ikke-reagerende, blåligt ansigt/læber, mulige gastrointestinale problemer, såsom diarré eller kvalme. Patienter med indlæggelseskriterier på intensiv afdeling, såsom forvirring eller takykardi (> 125/min) eller åndedrætsbesvær eller takypnø (> 22/min) eller hypotension <90/60 mmHg eller SPO2 <93 % vil blive inkluderet i gruppen III. Patienter med centralnervesystemet og hjerteinvolvering vil også blive direkte inkluderet i gruppen af ​​alvorlige tilfælde.

Prøveindsamling og -håndtering Ca. 10 ml perifert veneblod vil blive opsamlet under strenge aseptiske forhold ved ren venepunktur ved hjælp af vakuum-blodopsamlingsrør og vil blive fordelt som 3 ml i EDTA-rør til fuldstændig blodtælling og DNA-ekstraktion, 3 ml i en anden steril special. RNA-beskyttende rør (opbevaret ved -80 °C) til miRNA-ekstraktion. Derudover vil 4 ml i et plan rør få lov til at størkne ved stuetemperatur og derefter blive centrifugeret ved 3000 rpm i 10 minutter, og det opsamlede serum vil blive opbevaret ved -80°C til brug til analyse af cytokin og andre specifikke tests.På den 7. behandlingsdag vil der blive udtaget anden prøve under de samme betingelser, og til sidst på den 21. dag vil der blive taget tredje prøver.

Laboratorieundersøgelser RNA-ekstraktion blev udført i henhold til miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (kat. ingen. 217204) https:// www.qiagen.com/

Ekspressionerne af udvalgte miRNA'er og gener blev analyseret ved hjælp af Real-Time PCR. Listen over nødvendige sæt, kemikalier og forbrugsstoffer er som følger:

miRCURY LNA RT-kit (kat.nr.: 339340) miRCURY LNA miRNA PCR-analyse (200) (kat.nr.: 339306) miRCURY LNA SYBR Grøn PCR-kit (600) (kat.nr.: 339346) miRCURY LNA SYBR grøn) (Kat. Nr: 339345) PAXgene Blood miRNA Kit (50) (Kat. Nr.: 763134) miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) (Kat. Nr.: 217184) PCR-rør 0,2 ml (1000) (Kat. Nr.: 981005) FILTER TF/1TIUL P-10,RAC (Kat.nr.: TF-10-R-S) TF/100UL FILTERSPIPS TIL (Kat.nr.: TF-100-R-S) TF /1000UL UNIVERSELLE FILTERTIPS (Kat.nr.: TF-1000-R-S)

Kit og forbrugsvarer, der kræves til DNA-methyleringsanalyse:

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps (Kat.nr.: D5006) ZymoResearch Human Methyleret & Ikke-methyleret DNA Sæt (DNA m/ primere) 1 sæt (Kat.nr.: D5014) ZymoResearch ZymoTaq qPCR Reactions Premix 2500 ) Primær syntese forbrugsstof til 1 genregion AXYGEN 0,5 ml tyndvæggede PCR-rør, flad hætte. Clear1000 (kat.nr.: PCR-05-C) Capp 2,0 ml kogesikre mikrorør. Clear 1000 (Kat.nr.: MCT-200-C) Capp 10 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipetspidser 10 stativ (Kat.nr.: 5.030.010) Capp 200 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (gule spidser) 10 stativ (kat.nr.: 4.130.075) Capp 1000 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (blå spidser) 10 stativ (kat.nr.: 4.130.135) Bio Molecular Systems mikrofonrør og hætter 1 æske: 20 stativer med 48 rør/stativ, 960 rør i strimler af 4 med matchende hætter (kat.nr.: MIC-TUBES960).

Motivationselementet bag valget af miRNA'er i det aktuelle arbejde er et produkt af følgende integrerede online databaser til forudsigelse af miRNA-mål og funktionel analyse.http://microrna.osumc.edu, https://www.genecards.org. http://www.mirdb.org/miRDB/ Genforeningsnetværk med ACE2, TMPRSS2, PARP, HOX1 gener i COVID 19 tilfælde blev analyseret ved hjælp af GeneMANIA (Multiple Association Network Integration Algorithm) til forudsigelse af mulige funktionelle interaktioner mellem dem (http://www. genemania.org).