Epigenetiska verktyg som prognostiska prediktorer i Covid19

Målen med denna observationsstudie är 1) Att undersöka varför COVID-19-infektion orsakar olika biologiska beteendemönster hos individer, 2) Att bestämma rollen för epigenetiska mekanismer här för att upptäcka skillnaden mellan individer, 3) Att bestämma effektiviteten av detta beteende modell och mekanismer för klinisk behandling och för att säkerställa att de erhållna resultaten är ett steg för ytterligare behandlingsstudier, 4) Att utvärdera om data som erhålls i MicroRNA-analys är en prediktiv markör på prognos. Material och metoder Studiedesign Detta är en observationell prospektiv kohortstudie. I effektanalysen som utfördes med G * power 3.1-programmen relaterade till vår studie, visade sig effektstorleken för lymfocytprocenten och C-reaktivt protein vara 0,57 (Effektiv behandling av allvarliga COVID-19-patienter med Tocilizumab) (alfa-sannolikhet för fel = 0,05); i provbreddsanalysen, med effektvärdet 0,80, var det totala antalet patienter som skulle samlas in 105 (105/3 = 35 för varje grupp).

Patientkriterier Denna studie godkändes av Clinical Research Ethics Committee (2011- CREC-40) vid Bakırköy Dr.Sadi Konuk Training and Research Hospital och informerat samtycke kommer att erhållas från alla patienter enligt reglerna i Helsingforsdeklarationen. Godkännande av den lokala etiska kommitténs nummer är 2020/143 (2011-CREC-40). Patienter som är inskrivna i denna studie kommer att tas in på avdelningen för infektionssjukdomar och klinisk mikrobiologi och intensivvårdsavdelningen från maj 2020 till september 2020. Diagnosen av covid 19 kommer att bero på förekomsten av specifika lesioner i lungorna bekräftade med datortomografi (CT) och/eller laboratoriefynd enligt Republiken Turkiets hälsoministeriums diagnostiska kriterier.

Inklusionskriterier Alla patienter mellan 18 och 65 inkluderade kommer att drabbas av covid 19, och specifik behandling bör ännu inte påbörjas. COVID 19-diagnos av patienter kommer att baseras på fullständig medicinsk historia, noggrann klinisk undersökning, radiologisk avbildning, laboratoriebedömning och SARS-CoV-2-analys med RT-PCR.

Exklusions kriterier

1. Personer med kronisk lungsjukdom eller tidigare AC-operation
2. Personer med immunbrist eller cancerpatienter
3. Patienter som får immunsuppressiv behandling för autoimmun sjukdom
4. Personer med neurologiska sjukdomar som påverkar andningsmusklerna, såsom hypotoni.

På basis av inklusions- och exkluderingskriterierna kommer 105 patienter att inkluderas i denna studie, uppdelade i tre grupper; grupp I (n = 35) patienter är milda, grupp II (n = 35) patienter är måttliga och grupp III (n = 35) patienter är svåra och kritiska. Milda och måttliga fall definieras vanligtvis som de utan svår lunginflammation eller allvarligt akut respiratoriskt syndrom. Milda symtom är låggradig feber (högst 38 grader celsius), torr hosta, trötthet, halsont, huvudvärk, ny förlust av smak och lukt. Patienter med normala eller lindriga lunginflammationsfynd av radiologisk avbildning och blodlymfocytantal ≥800/µl och serum-CRP≤40 mg/l, ferritin ≤500ng/ml, D-Dimer ≤1000 ng/ml kommer att inkluderas i grupp I. Måttliga symtom är feber på ca 38,5-39 grader celsius, frossa, djup hosta, trötthet och värk i kroppen, muskelvärk, den allmänna känslan av att må dåligt. Patienter med bilaterala diffusa pneumonifynd av radiologisk avbildning eller blodlymfocytantal <800/µl eller serum-CRP> 40 mg/l eller ferritin> 500ng/ml eller D-Dimer> 1000 ng/ml kommer att inkluderas i grupp II. Allvarliga symtom är alla vanliga symtom som nämns ovan tillsammans med andfåddhet, obehag i bröstet, förvirring/inte svarar, blåaktigt ansikte/läppar, möjliga gastrointestinala problem, som diarré eller illamående. Patienter med intagningskriterier för intensivvårdsavdelning, såsom förvirring eller takykardi (> 125/min) eller andnöd eller takypné (> 22/min) eller hypotoni <90/60 mmHg eller SPO2 <93 % kommer att inkluderas i gruppen III. Patienter med centrala nervsystemet och hjärtpåverkan kommer också att direkt inkluderas i gruppen med svåra fall.

Provtagning och hantering Ungefär 10 ml perifert venöst blod kommer att samlas in under strikta aseptiska förhållanden genom ren venpunktion med hjälp av vakuumbloduppsamlingsrör och kommer att fördelas som 3 ml i EDTA-rör för fullständigt blodvärde och DNA-extraktion, 3 ml i en annan steril special. RNA-skyddsrör (förvaras vid -80 ° C) för miRNA-extraktion. Dessutom kommer 4 ml i ett plant rör att tillåtas koagulera vid rumstemperatur och sedan centrifugeras vid 3000 rpm i 10 minuter och det uppsamlade serumet kommer att förvaras vid -80°C för att användas för analys av cytokin och andra specifika tester.På den 7:e behandlingsdagen kommer ett andra prov att tas under samma förhållanden och slutligen, den 21:a dagen, kommer det tredje provet att tas.

Laboratorieundersökningar RNA-extraktion gjordes enligt miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (kat. Nej. 217204) https:// www.qiagen.com/

Uttrycken av utvalda miRNA och gener analyserades med realtids-PCR. Listan över nödvändiga kit, kemikalier och förbrukningsvaror är följande:

miRCURY LNA RT-sats (katnummer: 339340) miRCURY LNA miRNA PCR-analys (200) (kat. nr: 339306) miRCURY LNA SYBR Grön PCR-kit (600) (kat. nr: 339346) miRCURY LNA SY200 Grön PCR-sats (Kit Nr: 339345) PAXgene Blood miRNA Kit (50) (Katnummer: 763134) miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) (Katnummer: 217184) PCR-rör 0,2 ml (1000) (Kat. nr: 981005) FILTER TF/10PS P-10,RAC (Kat.nr: TF-10-R-S) TF/100UL FILTERSPÄXAR FÖR (Kat.nr: TF-100-R-S) TF /1000UL UNIVERSELLA FILTERSTIPS (Kat.nr: TF-1000-R-S)

Kit och förbrukningsvaror som krävs för DNA-metyleringsanalys:

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps (Kat nr: D5006) ZymoResearch Human Methylated & Non-methylated DNA Set (DNA med primers) 1 set (Cat nr: D5014) ZymoResearch ZymoTaq qPCR Reactions Premix 205 nr E ) Förbrukningsbar primär syntes för 1 genregion AXYGEN 0,5 ml tunnväggiga PCR-rör, platt lock. Clear1000 (Cat nr: PCR-05-C) Cap 2,0ml Koksäkra mikrorör. Clear 1000 (Katt nr: MCT-200-C) Capp 10 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet tips 10 rack (Kat nr: 5.030.010) Capp 200 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (gula spetsar) 10 rack (Cat no: 4.130.075) Capp 1000 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (Blue Tips) 10 rack (Cat no: 4.130.135) Bio Molecular Systems Mic Tubes and Caps 1 Box: 20 rack med 48 tuber/rack, 960 tuber i remsor om 4 med matchande lock (Katnummer: MIC-TUBES960).

Motivationselementet bakom valet av miRNA i det aktuella arbetet är en produkt av följande integrerade onlinedatabaser för miRNA-målförutsägelse och funktionsanalys.http://microrna.osumc.edu, https://www.genecards.org. http://www.mirdb.org/miRDB/ Genassocieringsnätverk med ACE2, TMPRSS2, PARP, HOX1-gener i COVID 19-fall analyserades med GeneMANIA (Multiple Association Network Integration Algorithm) för att förutsäga möjliga funktionella interaktioner mellan dem (http://www. genemania.org).