Herramientas epigenéticas como predictores pronósticos en Covid19

Los objetivos de este estudio observacional son 1) Investigar por qué la infección por COVID-19 provoca diferentes patrones de comportamiento biológico en los individuos, 2) Determinar el papel de los mecanismos epigenéticos aquí para detectar la diferencia entre los individuos, 3) Determinar la efectividad de este comportamiento modelo y mecanismos en el tratamiento clínico y asegurar que los resultados obtenidos sean un paso para futuros estudios de tratamiento, 4) Evaluar si los datos obtenidos en el análisis de MicroRNA son un marcador predictivo en el pronóstico. Material y métodos Diseño del estudio Se trata de un estudio observacional prospectivo de cohortes. En el análisis de poder realizado con los programas G* power 3.1 relacionados con nuestro estudio, se encontró que el tamaño del efecto para el porcentaje de linfocitos y proteína C reactiva fue de 0.57 (Tratamiento efectivo de pacientes graves con COVID-19 con tocilizumab) (probabilidad alfa de error = 0,05); en el análisis del ancho de muestra, tomando el valor de potencia 0,80, el número total de pacientes a recolectar fue de 105 (105/3 = 35 para cada grupo).

Criterios del paciente Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica (2011- CREC-40) en el Hospital de Capacitación e Investigación Bakırköy Dr.Sadi Konuk y se obtendrá el consentimiento informado de todos los pacientes de acuerdo con las reglas de la Declaración de Helsinki. El número de aprobación del comité de ética local es 2020/143 (2011-CREC-40). Los pacientes inscritos en este estudio serán admitidos en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica y en el Departamento de Cuidados Intensivos desde mayo de 2020 hasta septiembre de 2020. El diagnóstico de COVID 19 dependerá de la presencia de lesiones específicas en los pulmones confirmadas por tomografía computarizada (TC) y/o hallazgos de laboratorio de acuerdo con los criterios de diagnóstico del Ministerio de Salud de la República de Turquía.

Criterios de inclusión Todos los pacientes entre 18 y 65 años incluidos padecerán COVID 19, y aún no deben iniciar tratamiento específico. El diagnóstico de COVID 19 de los pacientes se basará en el historial médico completo, un examen clínico completo, imágenes radiológicas, evaluación de laboratorio y análisis de SARS-CoV-2 por RT-PCR.

Criterio de exclusión

1. Personas con enfermedad pulmonar crónica o cirugía AC previa
2. Personas con inmunodeficiencia o pacientes con cáncer.
3. Pacientes que reciben terapia inmunosupresora para enfermedades autoinmunes
4. Personas con enfermedades neurológicas que afecten a los músculos respiratorios, como la hipotonía.

Sobre la base de los criterios de inclusión y exclusión, se incluirán en este estudio 105 pacientes, divididos en tres grupos; los pacientes del grupo I (n = 35) son leves, los del grupo II (n = 35) son moderados y los del grupo III (n = 35) son graves y críticos. Los casos leves y moderados generalmente se definen como aquellos sin neumonía severa o síndrome respiratorio agudo severo. Los síntomas leves son fiebre baja (no más de 38 grados centígrados), tos seca, fatiga, dolor de garganta, dolor de cabeza, nueva pérdida del gusto y el olfato. Se incluirán en el grupo I los pacientes con neumonía normal o leve con hallazgos radiológicos y recuento de linfocitos en sangre ≥ 800/µl y PCR sérica ≤ 40 mg/l, ferritina ≤ 500 ng/ml, Dímero D ≤ 1000 ng/ml. Síntomas moderados son fiebre de aproximadamente 38,5-39 grados centígrados, escalofríos, tos profunda, fatiga y dolores corporales, dolor muscular, sensación general de malestar. Los pacientes con neumonía difusa bilateral hallazgos de imagen radiológica o recuento de linfocitos en sangre < 800/µl o PCR sérica > 40 mg/l o ferritina > 500 ng/ml o Dímero-D > 1000 ng/ml serán incluidos en el grupo II. Los síntomas graves son todos los síntomas comunes mencionados anteriormente junto con dificultad para respirar, malestar en el pecho, confusión/falta de respuesta, cara/labios azulados, posibles problemas gastrointestinales, como diarrea o náuseas. Se incluirán en el grupo pacientes con criterios de ingreso en la UCI (unidad de cuidados intensivos), como confusión o taquicardia (> 125/min) o dificultad respiratoria o taquipnea (> 22/min) o hipotensión <90/60 mmHg o SPO2 <93%. tercero Además, los pacientes con afectación del sistema nervioso central y del corazón se incluirán directamente en el grupo de casos graves.

Recogida y manipulación de muestras Se recogerán unos 10 ml de sangre venosa periférica en estrictas condiciones asépticas mediante venopunción limpia utilizando tubos de recogida de sangre al vacío y se distribuirán 3 ml en tubos EDTA para hemograma completo y extracción de ADN, 3 ml en otro tubo especial estéril. Tubo protector de ARN (almacenado a -80 °C) para la extracción de miARN. Además, 4 ml en un tubo plano se dejarán coagular a temperatura ambiente y luego se centrifugarán a 3000 rpm durante 10 minutos y el suero recolectado se almacenará a -80°C para ser utilizado para el análisis de citoquinas y otros. pruebas específicas. El día 7 de tratamiento se tomarán segundas muestras en las mismas condiciones y finalmente el día 21 se tomarán terceras muestras.

Investigaciones de laboratorio La extracción de ARN se realizó de acuerdo con el kit avanzado de suero/plasma miRNeasy (cat. No. 217204) https://www.qiagen.com/

Las expresiones de miARN y genes seleccionados se analizaron mediante PCR en tiempo real. La lista de kits, productos químicos y consumibles necesarios es la siguiente:

Kit miRCURY LNA RT (n.º de cat.: 339340) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (200) (n.º de cat.: 339306) miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (600) (n.º de cat.: 339346) miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (200) (cat. N.º de catálogo: 339345) PAXgene Blood miRNA Kit (50) (N.º de cat.: 763134) Kit miRNeasy Serum/Plasma (50) (N.º de cat.: 217184) Tubos PCR de 0,2 ml (1000) (N.º de cat.: 981005) PUNTAS CON FILTRO TF/10UL PARA P-10,RAC (n.º de catálogo: TF-10-R-S) PUNTAS CON FILTRO TF/100UL PARA (N.º de catálogo: TF-100-R-S) PUNTAS CON FILTRO UNIVERSAL TF ​​/1000UL (n.º de catálogo: TF-1000-R-S)

Kit y consumibles necesarios para el análisis de metilación del ADN:

ZymoResearch EZ DNA Methylation-Gold™ Kit 200 Preps (Cat no: D5006) ZymoResearch Human Methylated & Non-methylated DNA Set (DNA w/ primers) 1 set (Cat no: D5014) ZymoResearch ZymoTaq qPCR Premix 200 Reactions (Cat no: E2055 ) Consumible de síntesis primaria para 1 región génica AXYGEN Tubos de PCR de pared delgada de 0,5 ml, tapa plana. Clear1000 (n.º de cat.: PCR-05-C) Capp Microtubos a prueba de ebullición de 2,0 ml. Clear 1000 (n.º de cat.: MCT-200-C) Capp 10 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet tips 10 gradilla (n.º de cat.: 5.030.010) Capp 200 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (puntas amarillas) 10 gradilla (n.º de cat.: 4.130.075) Capp 1000 ul Dnase, Rnase Free Bulk Pipet ucu (puntas azules) 10 gradilla (n.º de cat.: 4.130.135) Bio Molecular Systems Mic Tubes and Caps 1 caja: 20 gradillas de 48 tubos/gradilla, 960 tubos en tiras de 4 con tapas a juego (Cat no: MIC-TUBES960).

El elemento de motivación detrás de la elección de los miARN en el trabajo actual es un producto de las siguientes bases de datos en línea integradas para la predicción del objetivo de miARN y el análisis funcional. http://microrna.osumc.edu, https://www.genecards.org. http://www.mirdb.org/miRDB/ Las redes de asociación de genes con genes ACE2, TMPRSS2, PARP, HOX1 en casos de COVID 19 se analizaron utilizando GeneMANIA (Multiple Association Network Integration Algorithm) para la predicción de posibles interacciones funcionales entre ellos (http://www. genemania.org).