Účinky intervence středomořské diety u diabetického srdečního onemocnění

Uspořádání studie: Studie je prospektivní, nezaslepená, randomizovaná intervenční klinická studie srovnávající ModMeD se standardní kardiální dietou u 48 (24 na rameno) hospitalizovaných pacientů s DM typu II, u nichž je plánována CABG v MMC a kteří mají zůstat v nemocnici na čtyři (4) nebo více dnů před operací.

I když není možné zaslepit subjekty nebo klinické lékaře, laboratorní vyšetřovatelé zpracovávající vzorky a analyzující biologické reakce na intervenci budou zaslepeni. Konkrétně vzorky tkáně budou před přenosem do laboratoře deidentifikace a kódování.

Primární cíl: Zjistit, zda středomořská strava způsobuje rychlé změny v obsahu lipidů (jak bylo stanoveno hmotnostní spektrometrií) a v aktivitě srdečních buněk (stanoveno hladinou exprese ERBB2) u pacientů s TIIDM podstupujících operaci CABG v MMC.

Studijní zbraně:

1. Standardní dieta pro srdeční DM (SCaDMD) během hospitalizace (před a po operaci CABG)
2. Středomořská dieta (MedD) během pobytu na lůžku (před a po operaci CABG)

Nábor subjektů: Do MMC bude zařazeno 48 dospělých hospitalizovaných pacientů (věk ≥ 18 let s diagnózou DM II. typu s hladinou hemoglobinu A1c vyšší než 7,5 % a onemocněním koronárních tepen s plánovanou chirurgickou revaskularizací (CABG)). Mezi další kritéria zařazení patří plánovaná předoperační hospitalizace v délce alespoň 4 dnů a ochota mít omezenou nabídku středomořské stravy po dobu jejich pobytu v nemocnici.

Proces informovaného souhlasu: Prostřednictvím IRB-schválené částečné výjimky HIPAA bude klinický tým vyšetřovat vhodné pacienty, kteří jsou naplánováni na operaci CABG. Oprávněné subjekty osloví jejich klinický tým, aby posoudil zájem o účast ve studii. Pacienti, kteří projeví zájem, budou osloveni členem studijního týmu, aby studii plně vysvětlil a získal informovaný souhlas. Pacienti, kteří podepíší formulář informovaného souhlasu pro tento výzkum, budou souhlasit s tím, že: 1) budou mít základní tělesná měření, 2) budou randomizováni ke konzumaci středomořské stravy nebo standardní stravy s DM během pobytu v nemocnici, 3) podstoupí v tu dobu bioptickou proceduru jejich CABG a darovat tkáň komorového myokardu o velikosti přibližně zrnka rýže, 4) darovat tkáň obvykle vyřazenou při operaci (tkáň pravé srdeční síně, kosterní sval a tuk), 5) darovat celkem 30 ml krve odebrané v 3 časové body: před, během a 4 dny po operaci CABG, 6) k vyplnění dotazníků o jejich spotřebě potravy a 7) umožnění kontroly jejich lékařského záznamu pro informace o jejich kardiovaskulárním zdraví. Informovaný souhlas bude zahrnovat jednotlivé povinnosti pacienta, jako je přesné vyplnění dietního dotazníku a dodržování dietních omezení, včetně požadavku, aby rodiny pacientů nenosily pacientům potraviny mimo jídlo. Zainteresovaní pacienti a jejich rodiny budou mít dostatek příležitostí k dotazům.

Studijní postupy

Dietní dotazník: Po získání informovaného souhlasu všechny subjekty vyplní dietní dotazník (DHQ II), který jim poskytne registrovaný dietetik, který zaměstnává kardiologické oddělení na MMC. DHQ II je online dotazník o frekvenci jídla vyvinutý NIH (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about). Původní DHQI bylo vyvinuto oddělením pro hodnocení rizikových faktorů a ověřeno, aby se ukázalo, že poskytuje přiměřené odhady živin 26-29. DHQII je aktualizovaná verze s 10 dalšími potravinami (134 místo 124) a 8 doplňky stravy. DHQII má 4 verze, které se liší časovým rámcem a otázkami o velikosti porce. Využijeme jednoměsíční variantu (příloha A), která zahrnuje velikost porcí. Jedná se o dotazník, který si pacient sám vyplní a zabere asi hodinu. Subjektům bude nabídnuta online verze prostřednictvím přenosného tabletu nebo papírové verze. Data DHQII budou analyzována pomocí softwarového programu Diet*Calc volně dostupného od NCI (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/). Tento program generuje odhady příjmu živin a skupiny potravin pro standardní verze DHQII použité v této studii. Údaje z dietního dotazníku nám umožní provést řadu průzkumných analýz, které dosud nebyly zkoušeny. Budeme například hledat souvislosti mezi množstvím určitých druhů lipidů s příjmem nenasycených a nasycených tuků pacientem.

Základní antropometrie: Výška (m) a hmotnost (kg) budou měřeny pomocí standardního klinického vybavení a budou ověřeny členem studijního týmu. Tyto informace budou použity k výpočtu indexu tělesné hmotnosti (BMI) v době zápisu. Člen studijního týmu také změří obvod pasu a boků.

Randomizace: Poté, co byly subjekty podrobeny screeningu na způsobilost a poskytly informovaný souhlas, budou randomizovány v poměru 1:1 k jedné ze dvou dietních intervencí. Randomizace bude realizována statistikem studie a bude zahrnovat stratifikaci podle pohlaví ve střídavých blocích po 4 a 6. K vytvoření randomizačního schématu bude použit randomizér nQuery; randomizační seznam bude přenesen do zapečetěných, neprůhledných, sekvenčně číslovaných obálek, jedna sada pro každou vrstvu. V době randomizace se otevře další očíslovaná obálka, aby se určilo zařazení do studijní skupiny. Studijní dietologové zajistí, že budou sděleny a dodržovány dietní úkoly.

Standardní dieta pro srdeční DM (SCaDMD): Podle aktuálních výživových směrnic dostanou všichni jedinci standardní instrukce a dietní menu (příloha B) od dietologů MMC. na základě jejich diagnóz DM a koronárních onemocnění. Pacientům bude předepsána srdeční dieta, což je dieta s nízkým obsahem tuku, a pokud si to lékař přeje, může být případ od případu zahrnuta další omezení sodíku nebo sacharidů. Dietologové studie budou dohlížet na zaznamenávání spotřeby jídla denně od zařazení do 4. dne po operaci CABG prostřednictvím 1) přímého dotazování, 2) kontroly objednávek jídla zadaných pacientem a 3) vyšetření podnosů s jídlem po dokončení jídla.

Středomořská dieta (MedD): Dietologové registrovaní v MMC vytvořili podmenu (příloha C) ze stávajícího jídelního lístku MMC, který je v souladu se středomořskou dietou, jak je popsáno v Casas et al. (2016)20 a byl použit ve studii PREDIMED. Jediný rozdíl mezi středomořskou stravou použitou v této studii a použitou ve studii PREDIMED je vyloučení vína a sofrita, omáčky používané jako základ ve španělské, italské, portugalské a latinskoamerické kuchyni. Bylo to kvůli limitům jídelny MMC. Po randomizaci se studijní dietologové setkají se subjektem, aby prozkoumali ModMeD a vedli jejich výběr potravin. Studijní dietologové se také setkají s podlahovými sestrami, aby vysvětlili rozdíl mezi standardní stravou a středomořskou stravou a vysvětlili studijní postupy pro záznam spotřeby potravin. Dietologové studie budou dohlížet na zaznamenávání spotřeby jídla denně od zařazení do 4. dne po operaci CABG pomocí 1) přímého dotazování, 2) kontroly objednávek jídla zadaných pacientem a 3) vyšetření podnosů s jídlem po dokončení jídla.

Odběr biologického vzorku: Účastníkům studie budou během operace CABG odebrány ventrikulární srdeční tkáň, síňová srdeční tkáň a kosterní mezižeberní svalstvo. Vzorky krve budou odebírány ve třech časových bodech: 1) při zápisu (v den dotazníku a antropomorfních měření), 2) v den operace a 3) před propuštěním z nemocnice. Všechny vzorky budou deidentifikovány, kódovány, zabaleny podle předpisů kategorie B a přepraveny kurýrem do MMCRI. Vzorky obdrží, zaprotokoluje a zpracuje vyškolený laboratorní personál. Jakákoli přebytečná tkáň nevyužitá pro tuto studii bude uložena a distribuována BioBank pro nespecifikovaný výzkum, pokud byl pro tento účel získán souhlas pacienta.

Manipulace se vzorky: Vzorky krve budou ponechány při pokojové teplotě po dobu 15-20 minut a poté centrifugovány po dobu 30 minut. Supernatant (sérum) bude odebrán a uložen na ledu pro transport do MMCRI. Provedli jsme testy pro hodnocení stability lipidů v krevním séru a zjistili jsme, že lipidy jsou stabilní po dobu až 3 hodin při pokojové teplotě. Veškerá tkáň bude co nejdříve zmražena a zmrazená na suchém ledu dopravena do MMCRI. Všechny vzorky séra a tkáně budou skladovány při -80ºC. Zkušenosti ukázaly, že vzorky zůstávají za těchto podmínek nezměněny déle než 1 rok. Analýza vzorků bude provedena po odebrání všech vzorků.

Komorová tkáň: Přední levá komora (LV), epikardiální biopsie volné stěny (1,5 mm x 1,5-7 mm hloubka/délka) bude získána od pacientů podstupujících bypassovou operaci jejich kardiochirurgem v době operace25,30. Konkrétně bude biopsie provedena po zahájení perfuze kardiopulmonálního bypassu a po sevření aorty a podání kardioplegie. Pro biopsii bude vybrána oblast o velikosti přibližně zrnka rýže na povrchu přední stěny levé komory bez epikardiálního tuku. Biopsie bude prováděna souběžně s jinými postupy, aby se pacient připravil na štěpy a nebude prodlužovat celkovou dobu operace. Tkáň bude umístěna do fyziologického pufrovacího roztoku pro izolaci buněk nebo extrakci lipidů pro lipidomické profilování. Izolace buněk budou provedeny co nejdříve po přijetí tkáně na MMCRI. Tkáň, která bude použita pro extrakci lipidů, může být zmražena na -80ºC.

Síňová tkáň: Síňová tkáň bude pocházet z vyřazeného ouška pravé síně (RAA) během operace. Síňová tkáň je podstatně větší než ventrikulární biopsie a umožňuje nám rozdělit každý vzorek. Jeden kus bude umístěn do fyziologického pufru pro izolaci buněk. Druhý kus bude umístěn do formalínu a použit pro imunofluorescenci. Třetí bude uložen v roztoku RNAlater® pro stabilizaci RNA až do extrakce. Konečný kus bude zmražen pro izolaci frakcí caveolae, lipidomické a proteinové profilování a western blotting.

Kosterní mezižeberní svalová tkáň: Mezižeberní sval je během operace odstraněn, aby se získal přístup k levé vnitřní prsní tepně, která se používá k poskytnutí bypassu. Vyřazený mezižeberní kosterní sval bude rozdělen na dva kusy, jeden zmrazený pro izolaci frakcí caveolae, lipidomické a proteinové profilování a western blotting, a druhý buď umístěn do formalínu a použit pro imunofluorescenci, umístěn do fyziologického pufru pro izolaci buněk, nebo umístěny do roztoku RNAlater® ke stabilizaci RNA až do extrakce.

Krev: Základní vzorek krve bude odebrán venepunkcí jednou před chirurgickým zákrokem (v den podání dietního dotazníku, když má pacient denně klinicky indikované odběry krve), aby se vyhodnotila monocytární exprese CAV a také plazmatické lipidomické profily. Kontrolní vzorky krve budou odebrány ve dvou dalších časových bodech: v den operace centrální linií a 4 dny po operaci a před propuštěním venipukcí. Vzorky krve budou odebírány do 2 zkumavek o objemu 5 ml, zkumavky s antikoagulantem ACD (Acid Citrate Dextrose) a zkumavky SST s červeným uzávěrem a zchlazeny nebo zpracovány do 3 hodin.

Shromažďování dat: Lékařské záznamy účastníků budou přezkoumány s cílem získat abstraktní demografické a klinické údaje, jak je uvedeno níže. Sběr údajů o pacientech bude probíhat při zápisu a přibližně 1 měsíc po operaci (maximálně po dobu tří šesti měsíců). Data budou vložena do databáze REDCap specifické pro studii, vyhovující HIPAA, spolu s daty specifickými pro intervence (data z dotazníků, antropomorfní měření a informace o stravě). Tato data, která zahrnují jména pacientů a další identifikátory, budou přístupná pouze klinickým zkoušejícím. Laboratorní data budou uchovávána samostatně. Klinická data budou kódována a exportována pro porovnání s laboratorními daty a analýzou bez dalších osobních identifikátorů. Odkaz na kód bude přístupný pouze klinickým zkoušejícím.

Osobně identifikovatelné informace

1. název
2. Datum narození
3. Číslo lékařského záznamu
4. Den přijetí do nemocnice
5. Datum operace
6. Datum propuštění 7.7.2 Demografie

1. Věk (roky) 2. Pohlaví (F/M) 3. Rasa/etnická příslušnost (kategorie OMB) 4. Historie kouření (nikdy/bývalý/současný; pokud bývalý/současný, roky ve smečce) 7.7.2 Zdravotní historie

1. Datum diagnózy
2. hladiny HbA1c
3. Standardní údaje o lipidovém profilu 7.7.2 Informace o lécích v době zápisu

1. Antidiabetika (léky, dávka, frekvence) 2. Léky snižující hladinu lipidů (léky, dávka, frekvence) 3. Antihypertenziva (léky, dávka, frekvence) 7.7.3 Údaje specifické pro zkoušku

1. Skóre dietního dotazníku pro příjem živin a potravin
2. Antropomorfní míry (výška, váha, BMI, obvod boků a pasu)
3. Denní dodržování diety (ano nebo ne, pokud ne, která potravina nebyla dodržována)
4. Denní kalorický příjem
5. Hmotnost při zásahu
6. Čas odběrů vzorků krve
7. Data výzkumné laboratoře (data exprese ERBB2, data lipidomiky) 7.7.4 Klinické výsledky

1. Léky při propuštění 2. Pooperační morbidita a přežití 30 dní po operaci

8.0 Laboratorní postupy

8.1 Hladiny exprese ERBB a dalších proteinů: Exprese ERBB2 na povrchu buněk v buňkách síňového endotelu bude hodnocena průtokovou cytometrií. Také hladiny ERBB2, CAV1/3 a IRS-1 budou stanoveny Western blotem s použitím specifických protilátek (CAV1: BD# 610058, myš nebo buněčná signalizace; CAV3: BD# 610420, myší IRS-1: BD#611395 , myš. pY989-IRS-1: Santa Cruz, SC-17200-R, králík, celkem ERBB2: Life Technologies. pERBB2/Tyr1248: Millipore, 06-229, v kombinaci s kozím anti-králičím IgG konjugovaným FITC, Abcam, ab6717). Hladiny pAkt budou hodnoceny v cirkulujících monocytech odebraných z plné krve a také v izolovaných síňových a ventrikulárních endoteliálních buňkách.

Dodatečná analýza lipidů a proteinů: Lipidové složení základních vzorků plazmy bude porovnáno se složením získaným z odpovídajících vzorků síňové a ventrikulární tkáně, aby bylo možné posoudit, do jaké míry lipidy cirkulující nalačno představují obsah tkáně.

Suspenze nemyocytárních jednotlivých buněk bude připravena ze síňové tkáně pomocí štěpení kolagenázou II/dispázou II, jak je popsáno36. Hladiny ERBB receptoru a CAV1 a 2 ve spojení s buněčně specifickými markery budou měřeny průtokovou cytometrií.

Statistické úvahy

Velikost vzorku/síla: Pilotní data byla použita k určení pravděpodobných úrovní několika měření v naší studijní populaci a jedno jsme vybrali k použití pro analýzu síly, exprese ERBB2 na povrchu buněk v buňkách síňového endotelu. Pilotní data využívající průtokovou cytometrii založenou na fluorescenci odhalila průměr 9,56 a SD 3,14 pro toto měření u diabetických pacientů (obr. 3). Velikost cílového vzorku 24 pacientů v každé studijní skupině tedy umožní detekovat rozdíl 2,64 v tomto měření (předpokládá se, že je podobný v kontrolní skupině našim předběžným údajům a vyšší v intervenční skupině) s 80% silou a hladina významnosti 0,05. Sekundární analýzy obsahu lipidů v plazmě a signalizace monocytů budou analýzou opakovaných měření, která přidá další výkon vzhledem k tomu, že budeme mít více pozorování na osobu, a ubere určitou sílu vzhledem k nutnosti upravit hodnoty p pro vícenásobná srovnání podle časového bodu.

Analýzy: Toto bude analýza záměru léčit. Úspěšnost randomizace bude hodnocena porovnáním charakteristik pacienta na začátku s použitím proporcí nebo průměrů a SD pomocí chí-kvadrát testů nebo Studentových t-testů, podle potřeby. V rámci skupinových změn (tj. delta skóre) a rozdíly mezi skupinami v měřeních provedených v sériových časových bodech (krevní sérum) budou analyzovány pomocí smíšeného modelu opakovaných měření ANOVA; bude vyžadován smíšený model, protože pacienti budou mít pravděpodobně různou dobu trvání dietní expozice, a proto různý počet opakovaných opatření. Zájmovými proměnnými jsou čas, léčebná skupina a doba interakce podle léčby. Výsledky modelu budou použity k odhadu středních hodnot a změn v čase pro srovnání v rámci skupiny a mezi skupinami. Grafické techniky a hodnoty p specifické pro časový bod budou použity k identifikaci časového průběhu jakýchkoli pozorovaných změn, např. toho, jak rychle by dietní zásah mohl vést k rozdílům ve zkoumaných opatřeních. Významnost bude identifikována na úrovni P<0,05 s vhodnou úpravou pro vícenásobná srovnání tam, kde je to vhodné. V lipidomických analýzách bude nastavena míra falešného objevu 0,05 a budou hlášeny hodnoty P korigované na FDR. Lineární vztah mezi změnou specifických signalizačních opatření (hladiny ERBB) a změnou druhů lipidů (SM a další třídy) bude zkoumán pomocí Pearsonova korelačního koeficientu. Analýza bude provedena v SAS.