糖尿病性心疾患における地中海式食事介入の効果

研究デザイン: この研究は、MMC で CABG が予定されており、入院が予定されている 48 人 (腕あたり 24 人) の II 型糖尿病の入院患者を対象に、ModMeD と標準的な心臓食を比較する前向き非盲検無作為化介入臨床試験です。手術の4日以上前。

被験者や臨床医を盲目にすることは現実的ではありませんが、検体を処理し、介入に対する生物学的反応を分析する研究者は盲目にされます。 具体的には、組織サンプルは、研究室に転送される前に匿名化され、コード化されます。

主要な目的: MMC で CABG 手術を受ける TIIDM 患者において、地中海式食事が脂質含有量 (質量分析法で測定) および心臓細胞活性 (ERBB2 発現レベルで測定) に急速な変化を引き起こすかどうかを判断すること。

研究アーム:

1. 入院中の標準心臓DMダイエット（SCaDMD）（CABG手術前後）
2. 入院中の地中海式食事療法（MedD）（CABG手術前後）

被験者の募集：MMCに48人の入院患者が登録されます（ヘモグロビンA1cレベルが7.5％を超えるII型DMと診断された年齢18歳以上、および計画された外科的血行再建術（CABG）を伴う冠動脈疾患）。 その他の選択基準には、手術前に少なくとも 4 日間の予定された入院、および入院期間中、メニューを制限された地中海式ダイエットを希望することが含まれます。

インフォームド コンセント プロセス: IRB が承認した部分的な HIPAA 免除により、臨床チームは CABG 手術が予定されている適格な患者をスクリーニングします。 適格な被験者は、研究参加への関心を評価するために臨床チームからアプローチされます。 関心を示した患者は、研究チームのメンバーから連絡を受け、研究について十分に説明し、インフォームド コンセントを取得します。 この研究のインフォームド コンセント フォームに署名した患者は、次のことに同意したことになります。米粒ほどの大きさの心室心筋組織を提供すること、4) 通常は手術中に廃棄される組織 (右心房組織、骨格筋、脂肪) を提供すること、5) で採取した合計 30 ml の血液を提供すること。 3 つの時点: CABG 手術の前、最中、および 4 日後、6) 食物消費に関するアンケートに記入し、7) 心血管の健康情報について医療記録を確認できるようにします。 インフォームド コンセントには、食事に関するアンケートに正確に記入するなどの項目別の患者の責任、および患者の家族が外部の食品を患者に持ち込まないという要件を含む食事制限の順守が含まれます。 関心のある患者とその家族には、質問をする十分な機会が与えられます。

研究手順

食事アンケート：インフォームドコンセントを取得すると、すべての被験者は、MMCの心臓病入院フロアに配置された登録栄養士によって提供される食事アンケート（DHQ II）に記入します。 DHQ II は、NIH (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about) によって進められたオンラインの食物頻度アンケートです。 元の DHQI は、Risk Factor Assessment Branch によって開発され、妥当な栄養推定値を提供することを示すために検証されました 26-29。 DHQII は、さらに 10 の食品 (124 ではなく 134) と 8 つの栄養補助食品を含む更新版です。 DHQII には、時間枠と分量の質問が異なる 4 つのバージョンがあります。 ポーションサイズを含む1か月オプション（付録A）を利用します。 これは、患者が記入する自記式のアンケートで、所要時間は約 1 時間です。 被験者には、携帯タブレットまたは紙のバージョンを介してオンライン バージョンが提供されます。 DHQII データは、NCI (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/) から自由に入手できる Diet*Calc ソフトウェア プログラムを使用して分析されます。 このプログラムは、この研究で使用された DHQII の標準バージョンの栄養素と食品グループの摂取量推定値を生成します。 食事アンケートからのデータにより、これまでに試みられたことのない多くの探索的分析を行うことができます. たとえば、特定の脂質種の存在量と、患者の不飽和脂肪および飽和脂肪の摂取量との関連性を調べます。

ベースラインの人体測定: 身長 (m) と体重 (kg) は、標準的な臨床機器を使用して測定され、研究チームのメンバーによって検証されます。 この情報は、登録時にボディマス指数 (BMI) を計算するために使用されます。 調査チームのメンバーは、ウエストとヒップの周囲も測定します。

無作為化: 被験者が適格性についてスクリーニングされ、インフォームド コンセントが提供された後、2 つの食事介入のいずれかに 1:1 の比率で無作為化されます。 無作為化は研究統計学者によって実施され、4 と 6 の交互のブロックで性別による層別化を伴います。nQuery ランダマイザーを使用して無作為化スキームを作成します。無作為化リストは封印された不透明な連続番号の封筒に転送され、階層ごとに 1 セットずつ転送されます。 無作為化の時点で、研究グループの割り当てを決定するために、次の番号の付いた封筒が開かれます。 研究栄養士は、食事の割り当てが伝達され、守られていることを確認します。

標準心臓DMダイエット（SCaDMD）：現在の栄養ガイドラインに従って、すべての被験者はMMC栄養士から標準的な指示と食事メニュー（付録B）を受け取ります。 DMと冠動脈疾患の診断に基づいています。 患者は、低脂肪食である心臓食を処方され、開業医が希望する場合は、ケースバイケースで追加のナトリウムまたは炭水化物の制限が含まれる場合があります. 研究栄養士は、登録から CABG 手術後 4 日目まで、1) 直接の質問、2) 患者による食品注文のレビュー、および 3) 食事の完了時の食品トレイの検査によって、毎日記録された食品消費量の記録を監督します。

地中海ダイエット (MedD): MMC 登録栄養士は、既存の MMC 入院メニューからサブメニュー (付録 C) を作成しました。 (2016)20 であり、PREDIMED 試験で使用されました。 この研究で使用された地中海式食事と PREDIMED 試験で使用された地中海式食事との唯一の違いは、ワインと、スペイン、イタリア、ポルトガル、およびラテンアメリカの料理のベースとして使用されるソースであるソフリトが除外されていることです。 これは、MMC カフェテリアの制限によるものでした。 無作為化の際、研究栄養士は被験者と会い、ModMeD を確認し、食品の選択を指導します。 研究栄養士はまた、フロア看護師と会い、標準的な食事と地中海式食事の違いを説明し、食物消費を記録するための研究手順を説明します. 研究栄養士は、登録から CABG 手術後 4 日目まで、1) 直接質問、2) 患者による食品注文のレビュー、および 3) 食事の完了時の食品トレイの検査によって、毎日の食品消費の記録を監督します。

生物学的サンプル収集：心室心臓組織、心房心臓組織、および骨格肋間筋は、CABG手術中に研究参加者から収集されます。 血液サンプルは 3 つの時点で収集されます: 1) 登録時 (アンケートおよび擬人化測定の当日)、2) 手術当日、および 3) 退院前。 すべてのサンプルは匿名化され、コード化され、カテゴリー B の規制に従ってパッケージ化され、クーリエによって MMCRI に輸送されます。 サンプルは、訓練を受けたラボ担当者が受け取り、記録し、処理します。 この研究に利用されなかった余分な組織は、この目的で患者の同意が得られた場合、特定されていない研究のためにBioBankによって保管および配布されます。

検体の取り扱い: 血液検体を室温で 15 ～ 20 分間放置し、その後 30 分間遠心分離します。 上清（血清）を回収し、MMCRIに輸送するために氷上で保存します。 血清中の脂質の安定性を評価する試験を実施したところ、脂質は室温で最大 3 時間安定であることがわかりました。 すべての組織はできるだけ早く凍結し、ドライアイスで凍結してMMCRIに輸送します。 すべての血清および組織サンプルは、-80ºC で保存されます。 経験によると、サンプルはこれらの条件下で 1 年以上変化していません。 サンプル分析は、すべてのサンプルが収集されたときに実行されます。

心室組織: 左心室前部 (LV)、自由壁心外膜生検 (1.5 mm x 1.5-7 mm 深さ/長さ) は、手術時に心臓外科医によってバイパス手術を受ける患者から得られます25,30。 具体的には、生検は、心肺バイパス灌流が開始された後、大動脈がクランプされ、心臓麻痺が投与された後に実行されます。 心外膜脂肪のない左心室の前壁の表面にある米粒程度の大きさの領域が生検のために選択されます。 生検は、患者に移植片を準備するための他の処置と並行して実施され、手術時間全体に追加されることはありません。 組織は、細胞分離またはリピドミクスプロファイリングのための脂質抽出のために生理学的緩衝液に入れられます。 細胞分離は、組織が MMCRI で受領された後、できるだけ早く実行されます。 脂質抽出に使用される組織は、-80ºC で凍結できます。

心房組織: 心房組織は、手術中に破棄された右心耳 (RAA) から取得されます。 心房組織は心室生検よりかなり大きく、各サンプルを細分化することができます。 一枚は、細胞分離のための生理的緩衝液に入れられます。 2 番目の部分はホルマリンに入れ、免疫蛍光に使用します。 3 つ目は、抽出まで RNA を安定させるために RNAlater® Solution に保存されます。 最後の部分は、カベオラ画分の分離、リピドミクスおよびタンパク質のプロファイリング、ウェスタンブロッティングのために凍結されます。

骨格肋間筋組織:肋間筋は、バイパス移植を提供するために使用される左内胸動脈にアクセスするために手術中に除去されます。 破棄された肋間骨格筋は 2 つの部分に分割され、1 つはカベオラ画分の分離、リピドミクスおよびタンパク質プロファイリング、およびウエスタンブロット法のために凍結され、2 つ目はホルマリンに入れられて免疫蛍光に使用され、細胞分離のために生理的緩衝液に入れられます。 RNAlater® Solution に入れ、抽出まで RNA を安定させます。

血液：CAVの単球発現および血漿リピドミックプロファイルを評価するために、ベースライン血液サンプルを手術前に1回静脈穿刺で採取します（患者が毎日臨床的に示される採血を行っている場合の食事アンケート管理の当日）。 フォローアップの血液サンプルは、他の2つの時点で採取されます:中心線を介した手術当日と、手術の4日後、静脈穿刺を介した退院前。 血液サンプルは、2 本の 5 ml チューブ、ACD (クエン酸デキストロース) 抗凝固剤チューブ、および赤いキャップの SST チューブに収集され、3 時間以内に冷蔵または処理されます。

データ収集：参加者の医療記録は、以下に指定されているように、人口統計学的および臨床データを要約するためにレビューされます。 患者データの収集は、登録時と手術後約 1 か月間 (最大 3 6 か月間) に行われます。 データは、研究固有の HIPAA 準拠の REDCap データベースに、介入固有のデータ (アンケート データ、擬人化測定、食事情報) とともに入力されます。 患者の名前やその他の識別子を含むこれらのデータには、臨床研究者のみがアクセスできます。 検査データは別に保管されます。 臨床データはコード化され、実験室データとの照合および分析のために、他の個人識別子なしでエクスポートされます。 コードへのリンクは、臨床研究者のみがアクセスできます。

個人を特定できる情報

1. 名前
2. 生年月日
3. カルテ番号
4. 入院日
5. 手術日
6. 退院日 7.7.2 人口統計

1. 年齢 (年) 2. 性別 (女性/女性) 3. 人種/民族 (OMB カテゴリー) 4. 喫煙歴 (以前/以前/現在、以前/現在の場合は喫煙歴) 7.7.2 病歴

1. 診断日
2. HbA1c 値
3. 標準脂質プロファイルデータ 7.7.2 登録時のお薬情報

1. 抗糖尿病薬（薬、用量、頻度） 2. 脂質低下薬（薬、用量、頻度） 3. 降圧薬（薬、用量、頻度） 7.7.3 試験固有のデータ

1. 栄養素と食品群の摂取に関する食事アンケートのスコア
2. 擬人化測定 (身長、体重、BMI、ヒップ & ウエスト周囲径)
3. 毎日の食事順守（はいまたはいいえ。いいえの場合、順守していなかった食品はどれか）
4. 一日の摂取カロリー
5. 介入中の体重
6. 採血時期
7. 研究所データ（ERBB2発現データ、リピドミクスデータ） 7.7.4 臨床転帰

1. 退院時の投薬 2. 術後罹患率と術後 30 日生存率

8.0 検査手順

８．１ ＥＲＢＢおよび他のタンパク質の発現レベル：心房内皮細胞における細胞表面ＥＲＢＢ２発現は、フローサイトメトリーによって評価される。 また、ERBB2、CAV1/3、および IRS-1 のレベルは、特定の抗体を使用したウエスタンブロットによって決定されます (CAV1: BD# 610058、マウスまたは細胞シグナル伝達; CAV3: BD# 610420、マウス IRS-1: BD#611395 、 ねずみ。 pY989-IRS-1: サンタクルーズ、SC-17200-R、ウサギ、合計 ERBB2: Life Technologies。 ｐＥＲＢＢ２／Ｔｙｒ１２４８：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０６−２２９、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧと組み合わせて、Ａｂｃａｍ、ａｂ６７１７）。 pAktレベルは、全血から収集された循環単球、ならびに単離された心房および心室内皮細胞で評価されます。

追加の脂質およびタンパク質分析：ベースライン血漿サンプルの脂質組成を、対応する心房および心室組織サンプルから得られたものと比較して、空腹時循環脂質が組織含有量を表す程度を評価します。

非筋細胞単細胞懸濁液は、記載されているようにコラゲナーゼ II/ディスパーゼ II 消化を使用して心房組織から調製されます 36。 ＥＲＢＢ受容体ならびにＣＡＶ１および２のレベルを細胞特異的マーカーと共にフローサイトメトリーによって測定する。

統計上の考慮事項

サンプルサイズ/検出力: パイロットデータを使用して、研究集団におけるいくつかの測定値の可能性の高いレベルを決定し、検出力分析、心房内皮細胞における細胞表面 ERBB2 発現に使用するものを選択しました。 蛍光ベースのフローサイトメトリーを使用したパイロット データでは、糖尿病患者におけるこの測定値の平均値が 9.56、標準偏差が 3.14 であることが明らかになりました (図 3)。 したがって、各研究グループの 24 人の患者の目標サンプル サイズにより、この尺度で 2.64 の差を検出できます (対照グループでは予備データと同様であり、介入グループではより高いと仮定されます)、検出力は 80% で、 0.05 の有意水準。 血漿脂質含有量と単球シグナル伝達の二次分析は、反復測定分析になります。これは、1 人あたり複数の観察が行われることを考えると、追加の検出力を追加し、複数の比較のために p 値を調整する必要性を考えると、いくらかの検出力を取り除きます。

分析: これは治療目的の分析になります。 無作為化の成功は、必要に応じてカイ二乗検定またはスチューデントの t 検定を使用して比率または平均と SD を使用してベースラインで患者の特性を比較することによって評価されます。 グループ内の変更 (つまり、 デルタスコア）および一連の時点で取得された測定値（血清）のグループ間の違いは、混合モデル反復測定ANOVAによって分析されます。混合モデルが必要になるのは、患者は食事にさらされる期間が異なる可能性があり、したがって反復測定の数が異なる可能性があるためです。 関心のある変数は、時間、治療グループ、および治療相互作用による時間です。 モデルの結果は、グループ内およびグループ間の比較のために、平均値と経時変化を推定するために使用されます。 グラフィカルな手法と時点固有のp値を使用して、観察された変化の時間経過を特定します。たとえば、食事介入が調査された測定値の違いにつながる可能性がある速さなどです。 有意性は P < 0.05 レベルで識別され、該当する場合は多重比較の適切な調整が行われます。 リピドミクス分析では、0.05 の誤発見率が設定され、FDR 補正された P 値が報告されます。 特定のシグナル伝達測定値 (ERBB レベル) の変化と脂質種 (SM およびその他のクラス) の変化との間の線形関係は、ピアソンの相関係数を使用して調べられます。 分析は SAS で行われます。