Effetti dell'intervento della dieta mediterranea nella cardiopatia diabetica

Disegno dello studio: lo studio è uno studio clinico interventistico prospettico, non in cieco, randomizzato che confronta ModMeD con la dieta cardiaca standard in 48 (24 per braccio) pazienti ricoverati con DM di tipo II in programma per CABG presso MMC e che devono rimanere in ospedale per quattro (4) o più giorni prima dell'intervento.

Sebbene non sia possibile accecare i soggetti o i medici, gli investigatori di laboratorio che elaborano campioni e analizzano le risposte biologiche all'intervento saranno accecati. In particolare, i campioni di tessuto saranno anonimizzati e codificati prima del trasferimento al laboratorio.

Obiettivo primario: determinare se una dieta mediterranea provoca rapidi cambiamenti nel contenuto lipidico (come determinato dalla spettrometria di massa) e nell'attività delle cellule cardiache (come determinato dal livello di espressione di ERBB2) tra i pazienti con TIDM sottoposti a intervento di CABG presso MMC.

Braccia di studio:

1. Standard Cardiac DM Diet (SCaDMD) durante la degenza ospedaliera (prima e dopo l'intervento di CABG)
2. Dieta Mediterranea (MedD) durante la degenza ospedaliera (prima e dopo l'intervento di CABG)

Reclutamento dei soggetti: saranno arruolati 48 adulti ricoverati (età ≥ 18 anni con diagnosi di DM di tipo II con livello di emoglobina A1c superiore al 7,5% e malattia coronarica con rivascolarizzazione chirurgica pianificata (CABG)) presso MMC. Altri criteri di inclusione includono la degenza ospedaliera pre-chirurgica pianificata di almeno 4 giorni e la disponibilità ad avere il menu ristretto della Dieta Mediterranea per la durata della loro degenza ospedaliera.

Processo di consenso informato: tramite una rinuncia HIPAA parziale approvata dall'IRB, il team clinico esaminerà i pazienti idonei che sono programmati per la chirurgia CABG. I soggetti idonei saranno contattati dal loro team clinico per valutare l'interesse per la partecipazione allo studio. I pazienti che indicano interesse saranno contattati da un membro del team di studio per spiegare completamente lo studio e ottenere il consenso informato. I pazienti che firmano il modulo di consenso informato per questa ricerca avranno acconsentito a: 1) sottoporsi a misurazioni corporee di base 2) essere randomizzati a consumare una dieta mediterranea o la dieta standard per DM cardiaco durante la loro degenza ospedaliera, 3) sottoporsi a una procedura di biopsia al momento del loro CABG e donare tessuto del miocardio ventricolare delle dimensioni di circa un chicco di riso, 4) donare tessuto solitamente scartato durante l'intervento chirurgico (tessuto atriale destro cardiaco, muscolo scheletrico e grasso), 5) donare un totale di 30 ml di sangue raccolto a 3 punti temporali: prima, durante e 4 giorni dopo l'intervento di CABG, 6) per compilare questionari sul loro consumo di cibo e 7) consentire la revisione della loro cartella clinica per le loro informazioni sulla salute cardiovascolare. Il consenso informato includerà responsabilità dettagliate del paziente come il completamento accurato del questionario dietetico e il rispetto delle restrizioni dietetiche, incluso il requisito che le famiglie dei pazienti non portino alimenti esterni ai pazienti. Ai pazienti interessati e alle loro famiglie verrà data ampia opportunità di porre domande.

Procedure di studio

Questionario dietetico: dopo aver ottenuto il consenso informato, tutti i soggetti compileranno un questionario dietetico (DHQ II) fornito loro da un dietista registrato che lavora ai piani di ricovero di cardiologia presso MMC. Il DHQ II è un questionario online sulla frequenza alimentare avanzato dal NIH (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about). Il DHQI originale è stato sviluppato dal Risk Factor Assessment Branch e convalidato per dimostrare che fornisce stime nutrizionali ragionevoli 26-29. Il DHQII è una versione aggiornata con altri 10 prodotti alimentari (134 invece di 124) e 8 integratori alimentari. Il DHQII ha 4 versioni che differiscono per intervallo di tempo e domande sulla dimensione della porzione. Utilizzeremo l'opzione di un mese (Appendice A) che include le dimensioni delle porzioni. Questo è un questionario autosomministrato che deve essere compilato dal paziente che richiede circa un'ora. Ai soggetti verrà offerta la versione online tramite tablet portatile o una versione cartacea. I dati DHQII saranno analizzati utilizzando il programma software Diet*Calc disponibile gratuitamente presso l'NCI (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/). Questo programma genera stime di assunzione di nutrienti e gruppi di alimenti per le versioni standard del DHQII utilizzate in questo studio. I dati del questionario dietetico ci permetteranno di condurre una serie di analisi esplorative mai tentate prima. Ad esempio, cercheremo associazioni tra l'abbondanza di alcune specie lipidiche con l'assunzione di grassi saturi e insaturi da parte del paziente.

Antropometrici di base: l'altezza (m) e il peso (kg) saranno misurati utilizzando attrezzature cliniche standard e saranno verificati da un membro del team di studio. Queste informazioni verranno utilizzate per calcolare l'indice di massa corporea (BMI), al momento dell'arruolamento. Un membro del team di studio misurerà anche la circonferenza della vita e dell'anca.

Randomizzazione: dopo che i soggetti sono stati sottoposti a screening per l'idoneità e hanno fornito il consenso informato, verranno randomizzati in un rapporto 1: 1 a uno dei due interventi dietetici. La randomizzazione sarà implementata dallo statistico dello studio e comporterà la stratificazione per genere in blocchi alternati di 4 e 6. Il randomizzatore nQuery verrà utilizzato per creare lo schema di randomizzazione; l'elenco di randomizzazione verrà trasferito in buste sigillate, opache, numerate in sequenza, un set per ogni strato. Al momento della randomizzazione, verrà aperta la busta numerata successiva per determinare l'assegnazione del gruppo di studio. I dietisti dello studio assicureranno che gli incarichi dietetici vengano comunicati e seguiti.

Standard Cardiac DM Diet (SCaDMD): secondo le attuali linee guida nutrizionali, tutti i soggetti riceveranno istruzioni standard e il menu dietetico (Appendice B) da un dietista MMC. sulla base delle loro diagnosi di DM e malattia coronarica. Ai pazienti verrà prescritta una dieta cardiaca, che è una dieta a basso contenuto di grassi e, se lo desidera il medico, possono essere incluse ulteriori restrizioni di sodio o carboidrati caso per caso. I dietisti dello studio supervisioneranno la registrazione del consumo di cibo registrato quotidianamente dall'arruolamento fino al giorno 4 dopo l'intervento di CABG mediante 1) domande dirette, 2) revisione degli ordini di cibo effettuati dal paziente e 3) esame dei vassoi di cibo al termine dei pasti.

Dieta Mediterranea (MedD): i dietisti registrati MMC hanno creato un sottomenu (Appendice C) dal menu ospedaliero MMC esistente che è conforme alla dieta mediterranea come descritto da Casas et al. (2016)20 ed è stato utilizzato nello studio PREDIMED. L'unica differenza tra la dieta mediterranea utilizzata in questo studio e utilizzata nello studio PREDIMED è l'esclusione del vino e del sofrito, una salsa utilizzata come base nella cucina spagnola, italiana, portoghese e latinoamericana. Ciò era dovuto ai limiti della mensa MMC. Dopo la randomizzazione, i dietisti dello studio incontreranno il soggetto per rivedere il ModMeD e guidarne la selezione alimentare. I dietologi dello studio incontreranno anche gli infermieri di piano per spiegare la differenza tra la dieta standard e la dieta mediterranea e per spiegare le procedure dello studio per registrare il consumo di cibo. I dietisti dello studio supervisioneranno la registrazione del consumo di cibo ogni giorno dall'arruolamento fino al giorno 4 dopo l'intervento di CABG mediante 1) domande dirette, 2) revisione degli ordini di cibo effettuati dal paziente e 3) esame dei vassoi di cibo al termine dei pasti.

Raccolta di campioni biologici: Il tessuto cardiaco ventricolare, il tessuto cardiaco atriale e il muscolo scheletrico intercostale saranno raccolti dai partecipanti allo studio durante il loro intervento chirurgico di CABG. I campioni di sangue verranno raccolti in tre momenti: 1) al momento dell'arruolamento (il giorno del questionario e misurazioni antropomorfe), 2) il giorno dell'intervento chirurgico e 3) prima della dimissione dall'ospedale. Tutti i campioni saranno anonimizzati, codificati, imballati secondo i regolamenti di categoria B e trasportati tramite corriere a MMCRI. I campioni verranno ricevuti, registrati ed elaborati da personale di laboratorio addestrato. Qualsiasi tessuto in eccesso non utilizzato per questo studio sarà conservato e distribuito dalla BioBank per ricerche non specificate se è stato ottenuto il consenso del paziente per questo scopo.

Manipolazione dei campioni: i campioni di sangue verranno lasciati a temperatura ambiente per 15-20 minuti e poi centrifugati per 30 minuti. Il surnatante (siero) sarà raccolto e conservato in ghiaccio per il trasporto all'MMCRI. Abbiamo eseguito test per valutare la stabilità dei lipidi nel siero del sangue e abbiamo scoperto che i lipidi sono stabili fino a 3 ore a temperatura ambiente. Tutti i tessuti saranno congelati il ​​prima possibile e trasportati congelati su ghiaccio secco all'MMCRI. Tutti i campioni di siero e tessuto saranno conservati a -80ºC. L'esperienza ha dimostrato che i campioni rimangono invariati per più di 1 anno in queste condizioni. L'analisi del campione verrà eseguita quando tutti i campioni saranno stati raccolti.

Tessuto ventricolare: le biopsie epicardiche della parete libera del ventricolo sinistro anteriore (LV) (1,5 mm x 1,5-7 mm di profondità/lunghezza) saranno ottenute da pazienti sottoposti a intervento chirurgico di bypass dal loro cardiochirurgo al momento dell'intervento25,30. In particolare, la biopsia verrà eseguita dopo l'inizio della perfusione del bypass cardiopolmonare e una volta che l'aorta è stata bloccata e la cardioplegia è stata somministrata. Per la biopsia verrà scelta un'area della dimensione approssimativa di un chicco di riso sulla superficie della parete anteriore del ventricolo sinistro priva di grasso epicardico. La biopsia verrà eseguita in parallelo con altre procedure per preparare il paziente agli innesti e non si aggiungerà al tempo complessivo dell'intervento. Il tessuto sarà posto in una soluzione tampone fisiologica per l'isolamento cellulare o l'estrazione di lipidi per il profilo lipidico. Gli isolamenti cellulari verranno eseguiti il ​​prima possibile dopo che il tessuto è stato ricevuto al MMCRI. Il tessuto che verrà utilizzato per l'estrazione dei lipidi può essere congelato a -80ºC.

Tessuto atriale: Il tessuto atriale proverrà dall'appendice atriale destra scartata (RAA) durante l'intervento chirurgico. Il tessuto atriale è considerevolmente più grande della biopsia ventricolare e ci permette di suddividere ogni campione. Un pezzo sarà posto nel tampone fisiologico per l'isolamento cellulare. Un secondo pezzo verrà posto in formalina e utilizzato per l'immunofluorescenza. Il terzo sarà conservato in RNAlater® Solution per stabilizzare l'RNA fino all'estrazione. Il pezzo finale sarà congelato per l'isolamento delle frazioni caveolae, il profilo lipidico e proteico e il western blotting.

Tessuto muscolare intercostale scheletrico: il muscolo intercostale viene rimosso durante l'intervento chirurgico per accedere all'arteria mammaria interna sinistra, che viene utilizzata per fornire un innesto di bypass. Il muscolo scheletrico intercostale scartato sarà diviso in due pezzi, uno congelato per l'isolamento delle frazioni caveolae, il profilo lipidomico e proteico e il western blotting, e il secondo posto in formalina e utilizzato per l'immunofluorescenza, posto in tampone fisiologico per l'isolamento cellulare, o posto in RNAlater® Solution per stabilizzare l'RNA fino all'estrazione.

Sangue: un campione di sangue di base verrà prelevato tramite venopuntura una volta prima dell'intervento chirurgico (il giorno della somministrazione del questionario dietetico quando il paziente riceve prelievi di sangue giornalieri clinicamente indicati) per valutare l'espressione dei monociti di CAV e i profili lipidomici plasmatici. I campioni di sangue di follow-up verranno prelevati in altri due momenti: il giorno dell'intervento tramite una linea centrale e 4 giorni dopo l'intervento e prima della dimissione tramite prelievo venoso. I campioni di sangue verranno raccolti in 2 provette da 5 ml, una provetta anticoagulante ACD (Acid Citrate Dextrose) e una provetta SST con tappo rosso e refrigerate o processate entro 3 ore.

Raccolta dati: le cartelle cliniche dei partecipanti saranno riviste per astrarre dati demografici e clinici come specificato di seguito. La raccolta dei dati del paziente avverrà al momento dell'arruolamento e circa 1 mese dopo l'intervento chirurgico (per un massimo di tre sei mesi). I dati verranno inseriti in un database REDCap specifico per lo studio, conforme a HIPAA, insieme a dati specifici dell'intervento (dati del questionario, misurazioni antropomorfe e informazioni sulla dieta). Questi dati, che includono i nomi dei pazienti e altri identificatori, saranno accessibili solo agli investigatori clinici. I dati di laboratorio saranno mantenuti separatamente. I dati clinici saranno codificati ed esportati per il confronto con dati di laboratorio e analisi senza altri identificatori personali. Il collegamento al codice sarà accessibile solo ai ricercatori clinici.

Informazioni di identificazione personale

1. Nome
2. Data di nascita
3. Numero di cartella clinica
4. Giorno del ricovero in ospedale
5. Data dell'intervento
6. Data di dimissione 7.7.2 Demografia

1. Età (anni) 2. Sesso (F/M) 3. Razza/etnia (categorie OMB) 4. Storia del fumo (mai/precedente/presente; se precedente/presente, pack anni) 7.7.2 Storia medica

1. Data della diagnosi
2. Livelli di HbA1c
3. Dati standard del profilo lipidico 7.7.2 Informazioni sui farmaci al momento dell'iscrizione

1. Farmaci antidiabetici (farmaci, dose, frequenza) 2. Farmaci ipolipemizzanti (farmaci, dose, frequenza) 3. Farmaci antipertensivi (farmaci, dose, frequenza) 7.7.3 Dati specifici della prova

1. Punteggi del questionario dietetico per l'assunzione di nutrienti e gruppi di alimenti
2. Misure antropomorfiche (altezza, peso, BMI, circonferenza fianchi e vita)
3. Aderenza alla dieta quotidiana (sì o no; se no, quale alimento non era in aderenza)
4. Apporto calorico giornaliero
5. Peso durante l'intervento
6. Tempo di approvvigionamento del campione di sangue
7. Dati di laboratorio di ricerca (dati di espressione di ERBB2, dati di lipidomica) 7.7.4 Esiti clinici

1. Farmaci alla dimissione 2. Morbilità post-operatoria e sopravvivenza a 30 giorni dall'intervento

8.0 Procedure di laboratorio

8.1 Livelli di espressione di ERBB e di altre proteine: L'espressione di ERBB2 sulla superficie cellulare nelle cellule endoteliali atriali sarà valutata mediante citometria a flusso. Inoltre, i livelli di ERBB2, CAV1/3 e IRS-1 saranno determinati mediante Western blot utilizzando anticorpi specifici (CAV1: BD# 610058, mouse or Cell Signaling; CAV3: BD# 610420, mouse IRS-1: BD#611395 , topo. pY989-IRS-1: Santa Cruz, SC-17200-R, coniglio, totale ERBB2: Life Technologies. pERBB2/Tyr1248: Millipore, 06-229, in combinazione con FITC coniugato con IgG anti-coniglio di capra, Abcam, ab6717). I livelli di pAkt saranno valutati in monociti circolanti prelevati da sangue intero così come in cellule endoteliali atriali e ventricolari isolate.

Ulteriori analisi lipidiche e proteiche: la composizione lipidica dei campioni di plasma al basale sarà confrontata con quella ottenuta dai corrispondenti campioni di tessuto atriale e ventricolare per valutare il grado in cui i lipidi circolanti a digiuno rappresentano il contenuto tissutale.

La sospensione di cellule singole non miocitarie sarà preparata dal tessuto atriale utilizzando la digestione con collagenasi II/Dispasi II come descritto36. I livelli del recettore ERBB e di CAV1 e 2 insieme ai marcatori cellulari specifici saranno misurati mediante citometria a flusso.

Considerazioni statistiche

Dimensione del campione/Potenza: i dati pilota sono stati utilizzati per determinare i livelli probabili di diverse misure nella nostra popolazione di studio e ne abbiamo scelto uno da utilizzare per un'analisi di potenza, espressione di ERBB2 sulla superficie cellulare nelle cellule endoteliali atriali. I dati pilota che utilizzano la citometria a flusso basata sulla fluorescenza hanno rivelato una media di 9,56 e SD di 3,14 per questa misura nei pazienti diabetici (Fig. 3). Pertanto, la dimensione del campione target di 24 pazienti in ciascun gruppo di studio consentirà di rilevare una differenza di 2,64 in questa misura (si ipotizza che sia simile nel gruppo di controllo ai nostri dati preliminari e maggiore nel gruppo di intervento) con una potenza dell'80% e un livello di significatività di 0,05. Le analisi secondarie del contenuto lipidico plasmatico e della segnalazione dei monociti saranno analisi di misure ripetute, che aggiungeranno ulteriore potenza dato che avremo più osservazioni per persona e toglieranno un po' di potere data la necessità di regolare i valori p per confronti multipli per punto temporale.

Analisi: questa sarà un'analisi per intenzione di trattare. Il successo della randomizzazione sarà valutato confrontando le caratteristiche del paziente al basale utilizzando proporzioni o medie e SD utilizzando test chi-quadrato o test t di Student, a seconda dei casi. All'interno dei cambiamenti di gruppo (es. delta score) e le differenze tra i gruppi nelle misurazioni effettuate in punti temporali seriali (siero del sangue) saranno analizzate mediante ANOVA a misure ripetute del modello misto; il modello misto sarà richiesto perché è probabile che i pazienti abbiano una durata diversa dell'esposizione alimentare e, quindi, un numero diverso di misurazioni ripetute. Le variabili di interesse sono il tempo, il gruppo di trattamento e il tempo per interazione di trattamento. I risultati del modello saranno utilizzati per stimare i valori medi e cambiare nel tempo per i confronti all'interno del gruppo e tra i gruppi. Verranno utilizzate tecniche grafiche e valori p specifici del punto temporale per identificare il corso temporale di eventuali cambiamenti osservati, ad esempio, quanto velocemente l'intervento dietetico potrebbe portare a differenze nelle misure esaminate. La significatività sarà identificata al livello P<0,05, con opportune correzioni per confronti multipli ove applicabile. Nelle analisi lipidomiche verrà impostato un tasso di scoperta falsa di 0,05 e verranno riportati i valori P corretti per FDR. La relazione lineare tra il cambiamento nelle misure di segnalazione specifica (livelli di ERBB) e il cambiamento nelle specie lipidiche (SM e altre classi) sarà esaminata utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson. L'analisi sarà condotta in SAS.