Zřetelná odpověď regulačních buněk typu I T vylučujících CD4+CD25+Foxp3+ a IL-10 na klastrovou specifickou imunoterapii u dětí s alergickou rinitidou

Pacienti Návrhem byla jednoletá, randomizovaná otevřená studie s paralelními skupinami, ve které byli pacienti randomizováni v poměru 1:1 k podávání SIT s extraktem Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dánsko) nebo k pozorování se standardní farmakoterapií (kontrolní skupina).

Účastníci studie zahrnovali 50 dětí alergických na roztoče domácího prachu (HDM) ve věku 9-13 let, které dostávaly SIT s extraktem Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) po dobu jednoho roku. Ty byly porovnány s 21 dětmi alergickými na HDM ve věku 9-14 let, které sloužily jako kontroly. Všechny děti byly národnosti Han a byly rekrutovány z alergologické kliniky nemocnice TongRen v Pekingu. Měli v anamnéze středně těžkou nebo těžkou rinokonjunktivitidu vyvolanou HDM trvající nejméně tři roky. Každý pacient měl také pozitivní výsledek kožního prick testu (SPT) na Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Dánsko) s průměrem pupínků alespoň 6 mm a byl pozitivní na specifický imunoglobulin E (IgE) až Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Švédsko), s hodnotou RAST alespoň 0,7 kU/l. Děti s anamnézou astmatu nebo atopické dermatitidy byly vyloučeny. Děti podstupující imunoterapii byly přiřazeny k atopickým dárcům podle věku, pohlaví, odpovědi SPT na Der p, hladiny celkového IgE a specifického IgE až Der p (tabulka 1). Protokol studie byl schválen naší institucionální kontrolní komisí pro studie na lidech a od všech subjektů byl získán informovaný souhlas.

Protokol imunoterapie Dětem podstupujícím subkutánní imunoterapii byl podáván extrakt z Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dánsko) podle klastrového protokolu, který jsme popsali dříve[15]. V prvních šesti týdnech děti podstoupily návštěvy za účelem zvýšení dávky a dostaly dvě injekce s odstupem jedné hodiny se zvyšující se dávkou každý týden. Nejvyšší koncentrace, podaná v šestém týdnu, měla alergenní aktivitu 100 000 SQ/ml a obsahovala 9,8 μg/ml Der p1. Po šestém týdnu byl dávkovací interval zvýšen na jeden měsíc a zachován až do konce prvního roku. U pacientů randomizovaných do non-SIT skupiny byla perzistující rýma léčena farmakoterapií zahrnující intranazální steroidy a perorální antihistaminika. Intranazální steroidy byly během studie udržovány ve stejné dávce a podle potřeby byla používána antihistaminika. U obou skupin byly odebrány vzorky krve na začátku a po roční léčbě.

Klinické hodnocení Symptomy dětí s AR byly hodnoceny celkovým skóre 5 symptomů (T5SS), které zahrnuje výtok z nosu, kýchání, ucpaný nos a nazální a oční pruritus. Každý symptom byl hodnocen na stupnici 0-3 (0 = žádný, 3 = závažný). Užívání léků bylo denně hodnoceno a zaznamenáváno, jak bylo popsáno dříve [16]. Používaným lékům byla připisována arbitrární skóre (0,75 bodu za 1 vdechnutí nosních kortikosteroidů a 1 bod za 1 tabletu antihistaminika). Pacienti byli instruováni, aby používali pouze lokální steroidy (plus antihistaminika, pokud nezlepšily symptomy) a hlásili každé podání nebo změnu počáteční lékové terapie v deníku. Pacienti byli také instruováni, aby přestali užívat léky alespoň 7 dní před odběrem krve.

Průtoková cytometrie Periferní krev byla získána žilní punkcí a odebrána do heparinu bez konzervačních látek. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány pomocí Ficoll-Plaque Plus hustotní gradientové centrifugace (Amersham Biosciences, NJ, USA). Pro intracelulární detekci cytokinu byly PBMC (2 x 106 buněk/ml) stimulovány 10 μg/ml Der pl (D. pteronyssinus major alergen 1, Indoor Biotechnologies, Spojené království) po dobu 24 hodin. 25 ng/ml forbol 12-myristát 13-acetátu (PMA), 1 μg/ml ionomycinu a 1,7 μg/ml monensinu bylo přidáno při 37 °C na poslední čtyři hodiny stimulace (vše ze Sigma, Missouri, USA) .

Pro průtokovou cytometrii byly PBMC povrchově barveny při pokojové teplotě po dobu 20 minut anti-CD4-PerCP a anti-CD25-PE nebo izotypovou kontrolou (myší IgG1-PerCP nebo IgG1-PE) (vše od Beckman Coulter, CA, USA) . Pro intracelulární barvení Foxp3 byly buňky fixovány a permeabilizovány fixačním/permeabilizačním pufrem Foxp3, poté barveny anti-lidským Foxp3-FITC nebo izotypovou kontrolou (IgG1-FITC) (vše od BioLegend, CA, USA). Pro intracelulární cytokinovou analýzu byly PBMC stimulované Der p1 povrchově obarveny anti-CD3-APC a anti-CD8-PerCP a fixovány 4% paraformaldehydem/PBS. Po permeabilizaci pomocí permeabilizačního roztoku FACS (BD Pharmingen, CA, USA) byly buňky inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti s anti-IL-4-PE plus anti-IFN-y-FITC nebo anti-IL-10-PE plus anti-IL-4-FITC a každá protilátka byla porovnána s příslušným izotypem IgG1 jako kontrola (vše od BD Pharmingen). Různé T podskupiny byly vybrány pro podrobnou fenotypovou analýzu následovně: (1) Th1 buňky: IFN-y+IL-4-CD3+CD8- T buňky; (2) Th2 buňky: IL-4+IFN-y-CD3+CD8- T buňky; a (3) Tr1 buňky: IL-10+IL-4-CD3+CD8- T buňky. Pro každou analýzu bylo shromážděno alespoň 20 000 událostí. Analýza byla provedena pomocí průtokového cytometru FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC byly resuspendovány na 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI-1640 a stimulovány 10 ug/ml Der pl (D. pteronyssinus major alergen 1, Indoor Biotechnologies, Spojené království). Kultury byly inkubovány po dobu 6 dnů při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru obsahujícím 5 % CO2. Supernatanty z alergenem stimulovaných kultur PBMC byly testovány na přítomnost IFN-y, IL-4 a IL-10 pomocí ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Izolace CD4+CD25high Treg buněk Heparinizovaná krev byla získána od každého z osmi rekrutovaných dětí ošetřených SIT a osmi AR kontrol pro buněčnou izolaci a funkční analýzu. Poté, co byly non-CD4+ buňky v PBMC odstraněny pomocí LD kolony s biotin-protilátkovým koktejlem a antibiotinovými mikrokuličkami, byly CD4+ T buňky izolovány z PBMC negativní selekcí a CD4+CD25+ T buňky byly pozitivně selektovány z CD4+ T buněk. Nakonec byly frakce CD25- získány pomocí MS-magnetické kolony s použitím izolační soupravy pro lidské CD4+CD25+ regulační T buňky podle pokynů výrobce (Miltenyi Biotec, Německo). Buňky s nejvyšší expresí CD25 (CD25high) byly selektovány pomocí inkubace s limitním množstvím kuliček anti-CD25 protilátky (2 μl anti-CD25 kuliček/107 buněk)[17]. Průměrná čistota izolovaného CD4+ byla 95 % (93-97 %) a 76 % (72-88 %) pro CD4+CD25high T buňky, které byly Foxp3-pozitivní.

Supresivní kapacita CD4+CD25high Treg buněk Pro vyhodnocení supresivní kapacity CD4+CD25high Treg buněk byla analyzována buněčná proliferace a cytokiny. CD4+CD25- T buňky (respondéry) samotné nebo smíšené CD4+CD25- T buňky a CD4+CD25high T buňky (supresory) v poměru 2:1 byly kultivovány v konečném objemu 200 ul média RPMI-1640 s 10 ug /ml Der p1. Kultury byly inkubovány po dobu 6 dnů při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru s 5% CO2. Autologní ozářené PBMC (3000 rad) byly přidány v množství 2 x 105 jako antigen prezentující buňky ke kulturám CD4+CD25- T buněk. Ve všech případech byly jako negativní kontroly zahrnuty trojité jamky média. Šestý den bylo odebráno 100 ul supernatantu pro analýzu Th1 a Th2 cytokinů (IFN-y a IL-4) pomocí soupravy ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA). Buněčná proliferace CD4+CD25- T buněk byla poté hodnocena pomocí sady pro proliferaci buněk WST-8 (modifikovaná tetrazoliová sůl) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japonsko) podle protokolů výrobců. Výsledek proliferace byl vyjádřen jako absorbance při 450 nm kultivačního média.

Statistika Statistická významnost mezi skupinami byla analyzována pomocí Mann-Whitneyho testu. Význam změn v rámci skupiny před a po terapii byl stanoven pomocí neparametrického Wilcoxonova testu párů. Korelační koeficient r byl generován pomocí Pearsonovy korelace. Všechny analýzy byly provedeny pomocí statistického softwaru SPSS verze 13.0. Byla použita 5% hladina významnosti (α = 0,05), síla (1- β) rovna 90 %. Všechny testy byly dvoustranné a hodnoty P menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.