Resposta distinta de CD4+CD25+Foxp3+ e células T reguladoras secretoras de IL-10 tipo I à imunoterapia específica de cluster em crianças com rinite alérgica

Pacientes O projeto foi um estudo de grupo paralelo aberto randomizado de um ano em que os pacientes foram randomizados em uma proporção de 1:1 para receber SIT com extrato de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dinamarca) ou para observar com farmacoterapia padrão (grupo controle).

Os participantes do estudo incluíram 50 crianças alérgicas aos ácaros da poeira doméstica (HDM) com idades entre 9 e 13 anos, que receberam SIT com extrato de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) por um ano. Estes foram comparados com 21 crianças alérgicas ao HDM de 9 a 14 anos que serviram como controles. Todas as crianças eram de nacionalidade Han e foram recrutadas na clínica de alergia do Hospital TongRen de Pequim. Eles tinham uma história de rinoconjuntivite moderada ou grave induzida por HDM de pelo menos três anos de duração. Cada paciente também teve um resultado positivo no teste cutâneo (SPT) para Der p (ALK-Abello ', Hørsholm, Dinamarca) com um diâmetro de pápula de pelo menos 6 mm e foi positivo para imunoglobulina específica E (IgE) para Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suécia), com um valor RAST de pelo menos 0,7 kU/L. Crianças com história de asma ou dermatite atópica foram excluídas. As crianças submetidas à imunoterapia foram pareadas com doadores atópicos quanto à idade, sexo, resposta SPT ao Der p, IgE total e IgE específica ao Der p (Tabela 1). O protocolo do estudo foi aprovado por nosso conselho de revisão institucional para estudos humanos e o consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos.

Protocolo de imunoterapia Crianças submetidas a imunoterapia subcutânea receberam extrato de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dinamarca) de acordo com um protocolo de cluster que descrevemos anteriormente [15]. Nas primeiras seis semanas, as crianças foram submetidas a visitas para dosagem, recebendo duas injeções com uma hora de intervalo com uma dose crescente a cada semana. A concentração mais alta, dada na sexta semana, teve uma atividade alergênica de 100.000 SQ/ml e continha 9,8 μg/ml de Der p1. Após a sexta semana, o intervalo entre as doses foi aumentado para um mês e mantido até o final do primeiro ano. Para os pacientes randomizados para o grupo não SIT, a rinite persistente foi tratada com farmacoterapia, incluindo esteróides intranasais e anti-histamínicos orais. Os esteróides intranasais foram mantidos na mesma dose durante o estudo e os anti-histamínicos foram usados ​​conforme necessário. Amostras de sangue foram coletadas no início e após um ano de tratamento em ambos os grupos.

Avaliação clínica Os sintomas de crianças com RA foram avaliados pelo Total 5 Symptom Score (T5SS), que inclui rinorreia, espirros, congestão nasal e prurido nasal e ocular. Cada sintoma foi pontuado em uma escala de 0-3 (0 = nenhum, 3 = grave). O uso de medicamentos foi pontuado e registrado diariamente, conforme descrito anteriormente [16]. Pontuações arbitrárias foram atribuídas às drogas utilizadas (0,75 pontos para 1 sopro de corticosteróide nasal e 1 ponto para 1 comprimido de anti-histamínico). Os pacientes foram instruídos a usar apenas esteróides locais (mais anti-histamínicos se não melhorassem os sintomas) e a relatar cada administração ou variação da terapia medicamentosa inicial no diário. Os pacientes também foram instruídos a interromper os medicamentos pelo menos 7 dias antes da coleta de sangue.

Citometria de fluxo O sangue periférico foi obtido por punção venosa e coletado em heparina sem conservantes. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, NJ, EUA). Para detecção intracelular de citocinas, PBMCs (2 × 106 células/mL) foram estimuladas com 10 μg/mL de Der p1 (D. pteronyssinus major alérgeno 1, Indoor Biotechnologies, Reino Unido) por 24 horas. Vinte e cinco ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 1 μg/mL de ionomicina e 1,7 μg/mL de monensina foram adicionados a 37 °C durante as quatro horas finais de estimulação (todos da Sigma, Missouri, EUA) .

Para citometria de fluxo, as PBMCs foram coradas à temperatura ambiente por 20 minutos com anti-CD4-PerCP e anti-CD25-PE, ou controle de isotipo (camundongo IgG1-PerCP ou IgG1-PE) (todos da Beckman Coulter, CA, EUA) . Para a coloração intracelular de Foxp3, as células foram fixadas e permeabilizadas com tampão de fixação/permeabilização Foxp3, depois coradas com Foxp3-FITC anti-humano ou controle de isotipo (IgG1-FITC) (todos da BioLegend, CA, EUA). Para a análise de citocinas intracelulares, as PBMCs estimuladas por Der p1 foram coradas na superfície com anti-CD3-APC e anti-CD8-PerCP e fixadas com paraformaldeído a 4%/PBS. Depois de serem permeabilizadas usando FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, EUA), as células foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente com anti-IL-4-PE mais anti-IFN-γ-FITC ou anti-IL-10-PE mais anti-IL-4-FITC, e cada anticorpo foi combinado com um respectivo isotipo IgG1 como controle (todos da BD Pharmingen). Diferentes subconjuntos T foram selecionados para análise fenotípica detalhada como segue: (1) células Th1: células T IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-; (2) células Th2: células T IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-; e (3) células Tr1: células T IL-10+IL-4-CD3+CD8-. Para cada análise, pelo menos 20.000 eventos foram coletados. A análise foi conduzida usando um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, EUA).

ELISA PBMCs foram ressuspensos a 2 × 106 células/mL em meio RPMI-1640 e estimulados com 10 μg/mL de Der p1 (D. pteronyssinus major alérgeno 1, Indoor Biotechnologies, Reino Unido). As culturas foram incubadas por 6 dias a 37 ºC em incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Sobrenadantes de culturas de PBMCs estimuladas com alérgenos foram analisados ​​quanto à presença de IFN-γ, IL-4 e IL-10 por meio de ELISA (R&D Systems, Minneapolis, EUA).

Isolamento de células Treg CD4+CD25high Sangue heparinizado foi obtido de cada uma das oito crianças recrutadas tratadas com SIT e oito controles AR para isolamento celular e análise funcional. Depois que as células não CD4+ nas PBMCs foram removidas pela coluna LD com um coquetel de biotina-anticorpo e microesferas de antibiotina, as células T CD4+ foram isoladas das PBMCs por seleção negativa e as células T CD4+CD25+ foram selecionadas positivamente das células T CD4+. Finalmente, as frações CD25- foram recuperadas usando uma coluna magnética MS usando um kit de isolamento de células T reguladoras CD4+CD25+ humanas de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Alemanha). As células com a maior expressão de CD25 (CD25high) foram selecionadas por meio de incubação com uma quantidade limitante de grânulos de anticorpo anti-CD25 (2 μl de grânulos anti-CD25/107 células) [17]. A pureza média do CD4+ isolado foi de 95% (93-97%) e 76% (72-88%) para células T CD4+CD25high sendo Foxp3-positivo.

Capacidade supressiva de células Treg CD4+CD25high Para avaliar a capacidade supressiva de células Treg CD4+CD25high, a proliferação celular e citocinas foram analisadas. Células T CD4+CD25- (responsivas) sozinhas ou misturadas de células T CD4+CD25- e células T CD4+CD25high (supressoras) na proporção de 2:1 foram cultivadas em um volume final de 200 µl de meio RPMI-1640 com 10 µg /ml Der p1. As culturas foram incubadas por 6 dias a 37 ºC em incubadora umidificada com 5% de CO2. PBMCs irradiados autólogos (3000 rad) foram adicionados a 2 × 105 como células apresentadoras de antígeno a culturas de células T CD4+CD25-. Em todos os casos, poços de meio triplicado foram incluídos como controles negativos. No sexto dia, 100 µl de sobrenadante foram removidos para análise de citocinas Th1 e Th2 (IFN-γ e IL-4) com um kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, EUA). A proliferação celular de células T CD4+CD25- foi então avaliada usando um kit de proliferação celular WST-8 (sal de tetrazólio modificado) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japão) de acordo com os protocolos dos fabricantes. O resultado da proliferação foi expresso em absorbância a 450nm do meio de cultura.

Estatística A significância estatística entre os grupos foi analisada por meio do teste de Mann-Whitney. A significância das alterações intragrupo pré e pós-terapia foi determinada usando um teste não paramétrico de pares combinados de Wilcoxon. O coeficiente de correlação r foi gerado usando a correlação de Pearson. Todas as análises foram realizadas com o software estatístico SPSS versão 13.0. Foi utilizado nível de significância de 5% (α = 0,05), poder (1-β) igual a 90%. Todos os testes foram bicaudais e valores de P menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.