알레르기성 비염 소아에서 특정 면역 요법을 클러스터링하기 위한 CD4+CD25+Foxp3+ 및 IL-10-분비 유형 I T 조절 세포의 뚜렷한 반응

환자 설계는 1년 동안의 무작위 개방 라벨 병렬 그룹 연구로, 환자는 Dermatophagoides pteronyssinus 추출물(Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, 덴마크)로 SIT를 받거나 관찰하기 위해 1:1 비율로 무작위 배정되었습니다. 표준 약물 요법으로(대조군).

연구 참여자에는 9-13세의 집 먼지 진드기(HDM) 알레르기가 있는 어린이 50명이 포함되었으며, 이들은 1년 동안 Dermatophagoides pteronyssinus(Der p) 추출물로 SIT를 받았습니다. 이를 대조군으로 삼은 9-14세의 HDM 알레르기 어린이 21명과 비교했습니다. 모든 어린이는 한족이었고 베이징 통런 병원의 알레르기 클리닉에서 모집되었습니다. HDM 유발 중등도 또는 중증 비결막염의 병력이 최소 3년 이상 지속되었습니다. 각 환자는 또한 팽진 직경이 6mm 이상인 Der p(ALK-Abello', Hørsholm, 덴마크)에 대해 양성 피부단자시험(SPT) 결과를 보였고, Der p에 대한 특정 면역글로불린 E(IgE)에 대해 양성이었습니다( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden), 최소 0.7 kU/L의 RAST 값. 천식 또는 아토피 피부염의 병력이 있는 어린이는 제외되었습니다. 면역 요법을 받는 어린이는 연령, 성별, Der p에 대한 SPT 반응, 총 IgE 및 Der p 수준에 대한 특정 IgE에 대해 아토피 기증자와 일치되었습니다(표 1). 연구 프로토콜은 인간 연구에 대한 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

면역 요법 프로토콜 피하 면역 요법을 받는 어린이에게 이전에 설명한 클러스터 프로토콜에 따라 Dermatophagoides pteronyssinus 추출물(Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, 덴마크)을 투여했습니다[15]. 처음 6주 동안 아이들은 1시간 간격으로 2회 주사를 맞으며 매주 복용량을 늘리기 위해 방문했습니다. 6주차에 투여된 가장 높은 농도는 100,000 SQ/ml의 알레르기 활성을 나타냈고 9.8 μg/ml Der p1을 함유했습니다. 6주 후에는 투여 간격을 1개월로 늘리고 1년차 말까지 유지했다. non-SIT 그룹으로 무작위 배정된 환자의 경우 비강내 스테로이드 및 경구용 항히스타민제를 포함한 약물 요법으로 지속성 비염을 관리했습니다. 비강 내 스테로이드는 연구 기간 동안 동일한 용량으로 유지되었고 항히스타민제는 필요에 따라 사용되었습니다. 두 그룹 모두 기준선과 1년 치료 후 혈액 샘플을 채취했습니다.

임상 평가 AR 소아의 증상은 콧물, 재채기, 코막힘, 비강 및 안구 가려움증을 포함하는 총 5 증상 점수(T5SS)로 평가되었습니다. 각 증상은 0-3의 척도로 점수를 매겼습니다(0 = 없음, 3 = 심각함). 이전에 설명한 대로 약물 사용을 점수화하고 매일 기록했습니다[16]. 임의의 점수는 사용된 약물에 기인했습니다(비강 코르티코스테로이드 1퍼프에 대해 0.75점 및 항히스타민제 1정에 대해 1점). 환자는 국소 스테로이드(증상이 호전되지 않는 경우 항히스타민제 추가)만 사용하고 각 투여 또는 초기 약물 요법의 변형을 일기에 기록하도록 지시받았습니다. 환자들은 또한 채혈하기 최소 7일 전에 약물을 중단하도록 지시받았다.

유세포 분석 말초 혈액을 정맥 천자에 의해 채취하여 방부제가 없는 헤파린에 수집했습니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll-Plaque Plus 밀도 구배 원심분리(Amersham Biosciences, NJ, USA)에 의해 분리되었습니다. 사이토카인의 세포내 검출을 위해 PBMC(2 × 106 세포/mL)를 10 μg/mL Der p1(D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, United Kingdom)으로 24시간 동안 자극했습니다. 25 ng/mL 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 1 μg/mL 이오노마이신 및 1.7 μg/mL 모넨신을 자극의 마지막 4시간 동안 37°C에서 첨가했습니다(모두 미국 미주리주 시그마 소재). .

유세포 분석을 위해 PBMC를 실온에서 20분 동안 항-CD4-PerCP 및 항-CD25-PE 또는 이소형 대조군(마우스 IgG1-PerCP 또는 IgG1-PE)(모두 미국 캘리포니아주 베크만 쿨터 소재)으로 표면 염색했습니다. . Foxp3의 세포내 염색을 위해 세포를 고정하고 Foxp3 고정/투과 완충액으로 투과화한 다음 항인간 Foxp3-FITC 또는 이소형 대조군(IgG1-FITC)(모두 미국 캘리포니아주 바이오레전드 소재)으로 염색했습니다. 세포내 사이토카인 분석을 위해, Der p1-자극된 PBMC를 항-CD3-APC 및 항-CD8-PerCP로 표면 염색하고, 4% 파라포름알데히드/PBS로 고정하였다. FACS Permeabilizing Solution(BD Pharmingen, CA, USA)을 사용하여 투과화시킨 후 세포를 항-IL-4-PE + 항-IFN-γ-FITC 또는 항-IL-10-PE와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 플러스 항-IL-4-FITC, 그리고 각각의 항체는 대조군으로서 각각의 아이소타입 IgG1과 매치되었다(모두 BD Pharmingen으로부터). 상세한 표현형 분석을 위해 다음과 같이 상이한 T 서브세트를 선택하였다: (1) Th1 세포: IFN-γ+IL-4-CD3+CD8- T 세포; (2) Th2 세포: IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-T 세포; 및 (3) Tr1 세포: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T 세포. 각 분석에 대해 최소 20,000개의 이벤트가 수집되었습니다. FACSCalibur 유세포분석기(BD Biosciences, NJ, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다.

ELISA PBMC를 RPMI-1640 배지에 2 x 106 cells/mL로 재현탁하고 10 μg/mL Der p1(D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, United Kingdom)로 자극했습니다. 배양액은 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37ºC로 6일 동안 배양되었습니다. 알레르겐-자극된 PBMC 배양물로부터의 상등액을 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, USA)에 의해 IFN-γ, IL-4 및 IL-10의 존재에 대해 검정하였다.

CD4+CD25high Treg 세포의 분리 세포 분리 및 기능 분석을 위해 모집된 8명의 SIT 처리 소아 및 8명의 AR 대조군 각각으로부터 헤파린화된 혈액을 얻었다. 비오틴-항체 칵테일 및 항비오틴 마이크로비드를 포함하는 LD 컬럼에 의해 PBMC의 비-CD4+ 세포를 제거한 후, 음성 선택에 의해 CD4+ T 세포를 PBMC로부터 분리하고 CD4+ CD25+ T 세포를 CD4+ T 세포로부터 양성 선택하였다. 마지막으로, 제조업체의 지침(Miltenyi Biotec, 독일)에 따라 인간 CD4+CD25+ 조절 T 세포 분리 키트를 사용하는 MS-마그네틱 컬럼을 ​​사용하여 CD25- 분획을 회수하였다. 제한된 양의 항-CD25 항체 비드(2 μl의 항-CD25 비드/107 세포)와의 배양을 통해 CD25 발현이 가장 높은 세포(CD25high)를 선택했습니다[17]. 분리된 CD4+의 평균 순도는 Foxp3 양성인 CD4+CD25high T 세포의 경우 95%(93-97%) 및 76%(72-88%)였습니다.

CD4+CD25high Treg 세포의 억제 능력 CD4+CD25high Treg 세포의 억제 능력을 평가하기 위해 세포 증식 및 사이토카인을 분석하였다. CD4+CD25- T 세포(반응자) 단독 또는 CD4+CD25- T 세포와 CD4+CD25high T 세포(억제제)를 2:1 비율로 혼합하여 최종 부피 200 μl RPMI-1640 배지에서 10 μg /ml Der p1. 배양액은 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 37ºC로 6일 동안 배양되었습니다. 자가 조사된 PBMC(3000 rad)를 CD4+CD25-T 세포 배양물에 항원 제시 세포로서 2 x 105로 첨가하였다. 모든 경우에, 3중 배지 웰을 음성 대조군으로 포함시켰다. 6일째에 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 사용한 Th1 및 Th2 사이토카인(IFN-γ 및 IL-4) 분석을 위해 상청액 100μl를 제거했습니다. CD4+CD25-T 세포의 세포 증식은 제조사의 프로토콜에 따라 WST-8(modified tetrazolium salt) 세포 증식 키트(Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan)를 사용하여 평가하였다. 증식 결과는 배양액의 450nm에서 흡광도로 표현하였다.

통계 그룹 간의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 그룹 내 치료 전후 변화의 중요성은 비모수 Wilcoxon 일치 쌍 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 상관 계수 r은 Pearson 상관 관계를 사용하여 생성되었습니다. 모든 분석은 SPSS 버전 13.0 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 5% 유의 수준(α = 0.05), 검정력(1-β)은 90%로 사용되었습니다. 모든 테스트는 2-tailed였으며 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.