Respuesta distintiva de células reguladoras T tipo I secretoras de CD4+CD25+Foxp3+ e IL-10 a la inmunoterapia específica de grupo en niños con rinitis alérgica

Pacientes El diseño fue un estudio de un año, aleatorizado, abierto, de grupos paralelos en el que los pacientes fueron aleatorizados en una proporción de 1:1 para recibir SIT con extracto de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dinamarca) o para observar con farmacoterapia estándar (grupo control).

Los participantes del estudio incluyeron 50 niños alérgicos a los ácaros del polvo doméstico (HDM) de 9 a 13 años, que recibieron SIT con extracto de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) durante un año. Estos se compararon con 21 niños alérgicos a HDM de 9 a 14 años que sirvieron como controles. Todos los niños eran de nacionalidad Han y fueron reclutados de la clínica de alergias del Hospital TongRen de Beijing. Tenían antecedentes de rinoconjuntivitis moderada o grave inducida por HDM de al menos tres años de duración. Cada paciente también tuvo una prueba de punción cutánea (SPT) positiva para Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Dinamarca) con un diámetro de roncha de al menos 6 mm, y fueron positivos para inmunoglobulina E específica (IgE) para Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suecia), con un valor RAST de al menos 0,7 kU/L. Se excluyeron los niños con antecedentes de asma o dermatitis atópica. Los niños sometidos a inmunoterapia se emparejaron con donantes atópicos por edad, sexo, respuesta de SPT a Der p, niveles de IgE total e IgE específica a Der p (Tabla 1). El protocolo de estudio fue aprobado por nuestra junta de revisión institucional para estudios en humanos y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos.

Protocolo de inmunoterapia A los niños sometidos a inmunoterapia subcutánea se les administró extracto de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dinamarca) de acuerdo con un protocolo grupal que hemos descrito anteriormente [15]. En las primeras seis semanas, los niños se sometieron a visitas para aumentar la dosis, recibiendo dos inyecciones con una hora de diferencia con una dosis creciente cada semana. La concentración más alta, administrada en la sexta semana, tuvo una actividad alergénica de 100.000 SQ/ml y contenía 9,8 μg/ml de Der p1. Después de la semana seis, el intervalo de dosificación se aumentó a un mes y se mantuvo hasta el final del primer año. Para los pacientes aleatorizados al grupo sin SIT, la rinitis persistente se trató con farmacoterapia que incluía esteroides intranasales y antihistamínicos orales. Los esteroides intranasales se mantuvieron en la misma dosis durante el estudio y se usaron antihistamínicos según fuera necesario. Se tomaron muestras de sangre al inicio y después de un año de tratamiento en ambos grupos.

Evaluación clínica Los síntomas de los niños con RA se evaluaron mediante la puntuación total de 5 síntomas (T5SS), que incluye rinorrea, estornudos, congestión nasal y prurito nasal y ocular. Cada síntoma se calificó en una escala de 0 a 3 (0 = ninguno, 3 = grave). El uso de medicamentos se calificó y registró diariamente, como se describió anteriormente [16]. Se atribuyeron puntuaciones arbitrarias a los fármacos utilizados (0,75 puntos por 1 inhalación de corticosteroides nasales y 1 punto por 1 comprimido de antihistamínico). Se indicó a los pacientes que usaran solo esteroides locales (más antihistamínicos si no mejoraban los síntomas) y que informaran cada administración o variación de la terapia farmacológica inicial en el diario. También se instruyó a los pacientes para que suspendieran los medicamentos al menos 7 días antes de la toma de muestras de sangre.

Citometría de flujo Se obtuvo sangre periférica por punción venosa y se recogió en heparina sin conservantes. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, NJ, EE. UU.). Para la detección intracelular de citoquinas, se estimularon PBMC (2 × 106 células/mL) con 10 μg/mL de Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Reino Unido) durante 24 horas. Se agregaron veinticinco ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 1 μg/mL de ionomicina y 1,7 μg/mL de monensina a 37 °C durante las últimas cuatro horas de estimulación (todos de Sigma, Missouri, EE. UU.) .

Para la citometría de flujo, las PBMC se tiñeron en la superficie a temperatura ambiente durante 20 minutos con anti-CD4-PerCP y anti-CD25-PE, o control de isotipo (IgG1-PerCP de ratón o IgG1-PE) (todos de Beckman Coulter, CA, EE. UU.) . Para la tinción intracelular de Foxp3, las células se fijaron y permeabilizaron con tampón de fijación/permeabilización de Foxp3, luego se tiñeron con Foxp3-FITC antihumano o control de isotipo (IgG1-FITC) (todo de BioLegend, CA, EE. UU.). Para el análisis de citoquinas intracelulares, las PBMC estimuladas con Der p1 se tiñeron en la superficie con anti-CD3-APC y anti-CD8-PerCP, y se fijaron con paraformaldehído al 4%/PBS. Después de permeabilizarse con la solución permeabilizante FACS (BD Pharmingen, CA, EE. UU.), las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con anti-IL-4-PE más anti-IFN-γ-FITC o anti-IL-10-PE. más anti-IL-4-FITC, y cada anticuerpo se comparó con un isotipo IgG1 respectivo como control (todos de BD Pharmingen). Se seleccionaron diferentes subconjuntos T para un análisis fenotípico detallado de la siguiente manera: (1) células Th1: células T IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-; (2) células Th2: células T IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-; y (3) células Tr1: células T IL-10+IL-4-CD3+CD8-. Para cada análisis, se recolectaron al menos 20,000 eventos. El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, EE. UU.).

Las PBMC ELISA se resuspendieron a 2 × 106 células/mL en medio RPMI-1640 y se estimularon con 10 μg/mL de Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Reino Unido). Los cultivos se incubaron durante 6 días a 37 ºC en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2. Se analizó la presencia de IFN-γ, IL-4 e IL-10 en los sobrenadantes de cultivos de PBMC estimulados con alérgenos mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.).

Aislamiento de células Treg CD4+CD25high Se obtuvo sangre heparinizada de cada uno de los ocho niños tratados con SIT reclutados y ocho controles AR para el aislamiento celular y el análisis funcional. Después de eliminar las células no CD4+ de las PBMC mediante una columna LD con un cóctel de biotina-anticuerpo y microesferas de antibiotina, las células T CD4+ se aislaron de las PBMC mediante selección negativa, y las células T CD4+CD25+ se seleccionaron positivamente de las células T CD4+. Finalmente, las fracciones de CD25- se recuperaron usando una columna magnética MS usando un kit de aislamiento de células T reguladoras CD4+CD25+ humanas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Alemania). Las células con la mayor expresión de CD25 (CD25high) se seleccionaron mediante incubación con una cantidad límite de microesferas de anticuerpos anti-CD25 (2 μl de microesferas anti-CD25/107 células)[17]. La pureza media de los CD4+ aislados fue del 95 % (93-97 %) y del 76 % (72-88 %) para los linfocitos T CD4+CD25high que eran positivos para Foxp3.

Capacidad supresora de las células Treg CD4+CD25high Para evaluar la capacidad supresora de las células Treg CD4+CD25high, se analizó la proliferación celular y las citocinas. Células T CD4+CD25- (respondedoras) solas o mezcladas Células T CD4+CD25- y células T CD4+CD25altas (supresoras) en una proporción de 2:1 se cultivaron en un volumen final de 200 µl de medio RPMI-1640 con 10 µg /ml Der p1. Los cultivos se incubaron durante 6 días a 37 ºC en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Se añadieron PBMC autólogas irradiadas (3000 rad) a 2 × 105 como células presentadoras de antígeno a cultivos de células T CD4+CD25-. En todos los casos, se incluyeron pocillos de medio por triplicado como controles negativos. En el día seis, se extrajeron 100 µl de sobrenadante para análisis de citocinas Th1 y Th2 (IFN-γ e IL-4) con un kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.). A continuación, se evaluó la proliferación celular de células T CD4+CD25- usando un kit de proliferación celular WST-8 (sal de tetrazolio modificada) (Kit de recuento celular-8, Dojin, Japón) según los protocolos de los fabricantes. El resultado de proliferación se expresó como absorbancia a 450nm del medio de cultivo.

Estadísticas La significación estadística entre los grupos se analizó mediante una prueba de Mann-Whitney. La importancia de los cambios intragrupo antes y después de la terapia se determinó mediante una prueba no paramétrica de pares emparejados de Wilcoxon. El coeficiente de correlación r se generó utilizando la correlación de Pearson. Todos los análisis se realizaron con el software estadístico SPSS versión 13.0. Se utilizó un nivel de significancia del 5% (α = 0,05), potencia (1- β) igual al 90%. Todas las pruebas fueron de 2 colas y los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.