Distinkt respons av CD4+CD25+Foxp3+ og IL-10-utskillende type I T-regulerende celler på klyngespesifikk immunterapi hos barn med allergisk rhinitt

Pasienter Designet var en ettårig, randomisert åpen parallellgruppestudie der pasienter ble randomisert i et 1:1-forhold for å motta SIT med Dermatophagoides pteronyssinus-ekstrakt (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) eller for å observere med standard farmakoterapi (kontrollgruppe).

Studiedeltakerne inkluderte 50 husstøvmidd (HDM)-allergiske barn i alderen 9-13 år, som fikk SIT med Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) ekstrakt i ett år. Disse ble sammenlignet med 21 HDM-allergiske barn i alderen 9-14 år som fungerte som kontroller. Alle barna var av Han-nasjonalitet og ble rekruttert fra allergiklinikken til Beijing TongRen Hospital. De hadde en historie med HDM-indusert moderat eller alvorlig rhino-konjunktivitt av minst tre års varighet. Hver pasient hadde også et positivt hudpriktest (SPT)-resultat for Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) med en wheal-diameter på minst 6 mm, og var positive for spesifikt immunglobulin E (IgE) til Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sverige), med en RAST-verdi på minst 0,7 kU/L. Barn med astma eller atopisk dermatitt i anamnesen ble ekskludert. Barna som gjennomgikk immunterapi ble matchet med atopiske donorer for alder, kjønn, SPT-respons på Der p, total IgE og spesifikke IgE til Der p-nivåer (tabell 1). Studieprotokollen ble godkjent av vår institusjonelle vurderingskomité for studier på mennesker og informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersoner.

Immunterapiprotokoll Barn som gjennomgikk subkutan immunterapi ble gitt Dermatophagoides pteronyssinus-ekstrakt (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Danmark) i henhold til en klyngeprotokoll som vi har beskrevet tidligere[15]. I de første seks ukene gjennomgikk barna besøk for oppdosering, og fikk to injeksjoner med en times mellomrom med økende dose hver uke. Den høyeste konsentrasjonen, gitt i den sjette uken, hadde en allergifremkallende aktivitet på 100 000 SQ/ml og inneholdt 9,8 μg/ml Der p1. Etter uke seks ble doseringsintervallet økt til en måned og opprettholdt til slutten av det første året. For pasienter randomisert til ikke-SIT-gruppe ble vedvarende rhinitt behandlet med farmakoterapi inkludert intranasale steroider og orale antihistaminer. Intranasale steroider ble holdt i samme dose under studien og antihistaminer ble brukt etter behov. Blodprøver ble tatt ved baseline og etter ett års behandling i begge grupper.

Klinisk evaluering Symptomer på AR-barn ble vurdert av Total 5 Symptom Score (T5SS), som inkluderer rhinoré, nysing, nesetetthet og nasal og okulær kløe. Hvert symptom ble skåret på en skala fra 0-3 (0 = ingen, 3 = alvorlig). Medisinbruk ble skåret og registrert daglig, som beskrevet tidligere [16]. Vilkårlige skårer ble tilskrevet stoffene som ble brukt (0,75 poeng for 1 drag av nasale kortikosteroider og 1 poeng for 1 tablett antihistamin). Pasientene ble bedt om å bruke kun lokale steroider (pluss antihistaminer hvis de ikke forbedret symptomene) og rapportere hver administrering eller variasjon av den innledende medikamentelle behandlingen i dagboken. Pasientene ble også bedt om å slutte med legemidler minst 7 dager før blodprøvetaking.

Flowcytometri Perifert blod ble oppnådd ved venøs punktering og samlet inn i konserveringsmiddelfritt heparin. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved hjelp av Ficoll-Plaque Plus tetthetsgradientsentrifugering (Amersham Biosciences, NJ, USA). For intracellulær påvisning av cytokin ble PBMC-er (2 × 106 celler/mL) stimulert med 10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannia) i 24 timer. 25 ng/mL forbol 12-myristat 13-acetat (PMA), 1 μg/mL ionomycin og 1,7 μg/mL monensine ble tilsatt ved 37 °C for de siste fire timene med stimulering (alle fra Sigma, Missouri, USA) .

For flowcytometri ble PBMC-er overflatefarget ved romtemperatur i 20 minutter med anti-CD4-PerCP og anti-CD25-PE, eller isotypekontroll (mus IgG1-PerCP eller IgG1-PE) (alle fra Beckman Coulter, CA, USA) . For intracellulær farging av Foxp3 ble celler fiksert og permeabilisert med Foxp3 fikserings-/permeabiliseringsbuffer, deretter farget med anti-human Foxp3-FITC eller isotypekontroll (IgG1-FITC) (alle fra BioLegend, CA, USA). For den intracellulære cytokinanalysen ble Der p1-stimulerte PBMC-er overflatefarget med anti-CD3-APC og anti-CD8-PerCP, og fiksert med 4% paraformaldehyd/PBS. Etter å ha blitt permeabilisert ved bruk av FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA), ble cellene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med anti-IL-4-PE pluss anti-IFN-γ-FITC, eller anti-IL-10-PE pluss anti-IL-4-FITC, og hvert antistoff ble matchet med en respektive isotype IgG1 som en kontroll (alle fra BD Pharmingen). Ulike T-undersett ble valgt for detaljert fenotypisk analyse som følger: (1) Thl-celler: IFN-y+IL-4-CD3+CD8-T-celler; (2) Th2-celler: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-celler; og (3) Trl-celler: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-celler. For hver analyse ble det samlet inn minst 20 000 hendelser. Analyse ble utført ved bruk av et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC-er ble resuspendert ved 2 × 106 celler/ml i RPMI-1640-medium og stimulert med 10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannia). Kulturer ble inkubert i 6 dager ved 37 ºC i en fuktet inkubator som inneholdt 5 % CO2. Supernatanter fra allergen-stimulerte PBMC-kulturer ble analysert for tilstedeværelse av IFN-y, IL-4 og IL-10 ved hjelp av ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Isolering av CD4+CD25high Treg-celler Heparinisert blod ble oppnådd fra hvert av åtte rekrutterte SIT-behandlede barn og åtte AR-kontroller for celleisolering og funksjonell analyse. Etter at ikke-CD4+-celler i PBMC-ene ble fjernet med LD-kolonne med en biotin-antistoff-cocktail og antibiotinmikrokuler, ble CD4+ T-celler isolert fra PBMC-ene ved negativ seleksjon, og CD4+CD25+ T-celler ble positivt selektert fra CD4+ T-cellene. Til slutt ble CD25- fraksjoner gjenvunnet ved bruk av en MS-magnetisk kolonne ved bruk av et humant CD4+CD25+ regulatorisk T-celleisolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec, Tyskland). Celler med høyest CD25-ekspresjon (CD25-høy) ble selektert gjennom inkubasjon med en begrenset mengde anti-CD25-antistoffkuler (2 μl anti-CD25-kuler/107 celler) [17]. Gjennomsnittlig renhet av den isolerte CD4+ var 95 % (93-97 %) og 76 % (72-88 %) for CD4+CD25-høye T-celler som var Foxp3-positive.

Undertrykkende kapasitet til CD4+CD25 høye Treg-celler For å evaluere den undertrykkende kapasiteten til CD4+CD25-høye Treg-celler, ble celleproliferasjon og cytokin analysert. CD4+CD25-T-celler (responders) alene eller blandede CD4+CD25-T-celler og CD4+CD25-høye T-celler (suppressorer) i et forhold på 2:1 ble dyrket i et sluttvolum på 200 µl RPMI-1640-medium med 10 µg /ml Der p1. Kulturer ble inkubert i 6 dager ved 37 ºC i en fuktet inkubator med 5 % CO2. Autologe bestrålte PBMC-er (3000 rad) ble tilsatt ved 2 × 105 som antigenpresenterende celler til CD4+CD25-T-cellekulturer. I alle tilfeller ble triplikatmediumbrønner inkludert som negative kontroller. På dag seks ble 100 µl supernatant fjernet for Th1- og Th2-cytokin (IFN-y og IL-4)-analyse med et ELISA-sett (R&D Systems, Minneapolis, USA). Celleproliferasjon av CD4+CD25-T-celler ble deretter vurdert ved bruk av et WST-8 (modifisert tetrazoliumsalt) celleproliferasjonssett (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) i henhold til produsentens protokoller. Proliferasjonsresultatet ble uttrykt som absorbans ved 450 nm av kulturmediet.

Statistikk Statistisk signifikans mellom grupper ble analysert ved hjelp av en Mann-Whitney-test. Betydningen av endringer i gruppen før og etter behandlingen ble bestemt ved å bruke en ikke-parametrisk Wilcoxon-matchede par-test. Korrelasjonskoeffisienten r ble generert ved å bruke Pearson-korrelasjonen. Alle analyser ble utført ved bruk av SPSS versjon 13.0 statistisk programvare. Et 5 % signifikansnivå ble brukt (α = 0,05), kraft (1- β) lik 90 %. Alle testene var 2-halede, og P-verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.