Отчетливый ответ CD4+CD25+Foxp3+ и IL-10-секретирующих Т-регуляторных клеток типа I на кластер-специфическую иммунотерапию у детей с аллергическим ринитом

Пациенты. Дизайн представлял собой однолетнее рандомизированное открытое исследование с параллельными группами, в котором пациенты были рандомизированы в соотношении 1:1 для получения СИТ с экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Дания) или для наблюдения со стандартной фармакотерапией (контрольная группа).

В исследование были включены 50 детей с аллергией на клещей домашней пыли (ДПВ) в возрасте 9-13 лет, которые получали СИТ с экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) в течение одного года. Их сравнивали с 21 ребенком с аллергией на HDM в возрасте 9-14 лет, которые служили контролем. Все дети были ханьской национальности и были набраны из клиники аллергии пекинской больницы Тунжэнь. У них в анамнезе был умеренный или тяжелый риноконъюнктивит, вызванный HDM, продолжительностью не менее трех лет. У каждого пациента также был положительный результат кожного прик-теста (КПТ) на Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Дания) с диаметром волдыря не менее 6 мм и положительный результат на специфический иммуноглобулин E (IgE) к Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Уппсала, Швеция) со значением RAST не менее 0,7 кЕд/л. Исключались дети с астмой или атопическим дерматитом в анамнезе. Дети, проходящие иммунотерапию, были сопоставимы с донорами с атопией по возрасту, полу, ответу КПТ на Der p, уровням общего IgE и специфического IgE к Der p (таблица 1). Протокол исследования был одобрен нашим институциональным наблюдательным советом по исследованиям на людях, и от всех субъектов было получено информированное согласие.

Протокол иммунотерапии Детям, проходящим подкожную иммунотерапию, давали экстракт Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Дания) в соответствии с кластерным протоколом, который мы описали ранее [15]. В первые шесть недель дети проходили визиты для повышения дозировки, получая две инъекции с интервалом в час с увеличением дозы каждую неделю. Самая высокая концентрация, введенная на шестой неделе, имела аллергенную активность 100 000 SQ/мл и содержала 9,8 мкг/мл Der p1. После шестой недели интервал дозирования был увеличен до одного месяца и сохранялся до конца первого года. У пациентов, рандомизированных в группу без СИТ, персистирующий ринит лечили с помощью фармакотерапии, включающей интраназальные стероиды и пероральные антигистаминные препараты. Интраназальные стероиды сохранялись в той же дозе во время исследования, а антигистаминные препараты применялись по мере необходимости. Образцы крови брали исходно и через год лечения в обеих группах.

Клиническая оценка. Симптомы у детей с АР оценивали по общей шкале из 5 симптомов (T5SS), которая включала ринорею, чихание, заложенность носа, зуд в носу и глазах. Каждый симптом оценивался по шкале от 0 до 3 (0 = отсутствие, 3 = тяжелый). Использование лекарств оценивалось и записывалось ежедневно, как описано ранее [16]. Произвольные баллы были приписаны используемым препаратам (0,75 балла за 1 ингаляцию назальных кортикостероидов и 1 балл за 1 таблетку антигистаминного препарата). Пациенты были проинструктированы использовать только местные стероиды (плюс антигистаминные препараты, если они не улучшали симптомы) и сообщать о каждом назначении или изменении начальной лекарственной терапии в дневнике. Пациентов также проинструктировали прекратить прием препаратов по крайней мере за 7 дней до забора крови.

Проточная цитометрия Периферическую кровь получали путем венозной пункции и собирали в гепарин без консервантов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, Нью-Джерси, США). Для внутриклеточной детекции цитокина РВМС (2 × 106 клеток/мл) стимулировали 10 мкг/мл Der p1 (основной аллерген 1 D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies, Соединенное Королевство) в течение 24 часов. Двадцать пять нг/мл форбола 12-миристата 13-ацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 1,7 мкг/мл монензина добавляли при 37 °C в течение последних четырех часов стимуляции (все от Sigma, штат Миссури, США). .

Для проточной цитометрии поверхность РВМС окрашивали при комнатной температуре в течение 20 минут анти-CD4-PerCP и анти-CD25-PE или изотипическим контролем (мышиный IgG1-PerCP или IgG1-PE) (все от Beckman Coulter, Калифорния, США). . Для внутриклеточного окрашивания Foxp3 клетки фиксировали и пермеабилизировали с помощью буфера для фиксации/пермеабилизации Foxp3, затем окрашивали анти-человеческим Foxp3-FITC или изотипическим контролем (IgG1-FITC) (все от BioLegend, Калифорния, США). Для анализа внутриклеточных цитокинов Der p1-стимулированные PBMC окрашивали поверхность анти-CD3-APC и анти-CD8-PerCP и фиксировали 4% параформальдегидом/PBS. После пермеабилизации с использованием пермеабилизирующего раствора FACS (BD Pharmingen, Калифорния, США) клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с анти-IL-4-PE плюс анти-IFN-γ-FITC или анти-IL-10-PE. плюс анти-IL-4-FITC, и каждое антитело было сопоставлено с соответствующим изотипом IgG1 в качестве контроля (все от BD Pharmingen). Для подробного фенотипического анализа были отобраны различные подмножества T следующим образом: (1) клетки Th1: IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-T-клетки; (2) Th2-клетки: IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-T-клетки; и (3) клетки Tr1: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-клетки. Для каждого анализа было собрано не менее 20 000 событий. Анализ проводили с использованием проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Нью-Джерси, США).

ELISA PBMC ресуспендировали в концентрации 2 × 106 клеток/мл в среде RPMI-1640 и стимулировали 10 мкг/мл Der p1 (главный аллерген 1 D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies, Соединенное Королевство). Культуры инкубировали в течение 6 дней при 37 ºC во влажном инкубаторе, содержащем 5% СО2. Супернатанты от культур стимулированных аллергеном РВМС анализировали на присутствие IFN-γ, IL-4 и IL-10 с помощью ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, США).

Выделение CD4+CD25high Treg-клеток Гепаринизированную кровь получали от каждого из восьми набранных детей, получавших СИТ, и восьми контролей с АР для выделения клеток и функционального анализа. После того, как не-CD4+ клетки в РВМС были удалены с помощью колонки LD с коктейлем биотин-антитело и микробусинами с антибиотином, CD4+ Т-клетки были выделены из РВМС с помощью негативной селекции, а CD4+CD25+ Т-клетки были положительно отобраны из CD4+ Т-клеток. Наконец, фракции CD25- были выделены с использованием магнитной колонки MS с использованием набора для выделения регуляторных Т-клеток CD4+CD25+ человека в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec, Германия). Клетки с наивысшей экспрессией CD25 (CD25high) отбирали посредством инкубации с ограничивающим количеством гранул анти-CD25-антител (2 мкл гранул анти-CD25/107 клеток) [17]. Средняя чистота выделенных CD4+ составляла 95% (93-97%) и 76% (72-88%) для CD4+CD25high Т-клеток, являющихся Foxp3-позитивными.

Супрессорная способность клеток CD4+CD25high Treg Для оценки супрессорной способности клеток CD4+CD25high Treg анализировали клеточную пролиферацию и цитокин. CD4+CD25-T-клетки (респондеры) отдельно или смешанные CD4+CD25-T-клетки и CD4+CD25high T-клетки (супрессоры) в соотношении 2:1 культивировали в конечном объеме 200 мкл среды RPMI-1640 с 10 мкг /мл Der p1. Культуры инкубировали в течение 6 дней при 37 ºC во влажном инкубаторе с 5% СО2. Аутологичные облученные РВМС (3000 рад) добавляли в количестве 2 × 105 в качестве антигенпрезентирующих клеток к культурам CD4+CD25-Т-клеток. Во всех случаях в качестве отрицательного контроля использовали три лунки со средой. На шестой день 100 мкл супернатанта удаляли для анализа цитокинов Th1 и Th2 (IFN-γ и IL-4) с помощью набора ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, США). Пролиферацию клеток CD4+CD25-T-клеток затем оценивали с использованием набора для пролиферации клеток WST-8 (модифицированная соль тетразолия) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) в соответствии с протоколами производителей. Результат пролиферации выражали как поглощение культуральной среды при 450 нм.

Статистическая значимость между группами была проанализирована с использованием критерия Манна-Уитни. Значимость внутригрупповых изменений до и после терапии определяли с помощью непараметрического парного критерия Уилкоксона. Коэффициент корреляции r был получен с использованием корреляции Пирсона. Все анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения SPSS версии 13.0. Использовался уровень значимости 5% (α = 0,05), мощность (1-β) равна 90%. Все тесты были двусторонними, и значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.