アレルギー性鼻炎の小児におけるクラスター特異的免疫療法に対する CD4+CD25+Foxp3+ および IL-10 分泌型 I T 制御細胞の明確な応答

患者 デザインは 1 年間の無作為化非盲検並行群間試験で、患者は 1:1 の比率で無作為に割り付けられ、ヤケヒョウヒダニ抽出物 (Alutard SQ、ALK-Abello'、Hørsholm、Denmark) による SIT を受けるか、観察する標準的な薬物療法（対照群）。

研究参加者には、イエダニ (HDM) アレルギーのある 9 歳から 13 歳の 50 人の子供が含まれ、1 年間、ヤケヒョウヒダニ (Der p) 抽出物を含む SIT を受けました。 これらは、対照として役立った 9 歳から 14 歳までの 21 人の HDM アレルギー児と比較されました。 すべての子供は漢民族で、北京同仁病院のアレルギークリニックから募集されました。 彼らは、少なくとも 3 年間、HDM による中等度または重度の鼻結膜炎の病歴がありました。 各患者は、Der p (ALK-Abello'、Hørsholm、Denmark) の皮膚プリック テスト (SPT) の結果も陽性で、膨疹の直径は少なくとも 6 mm であり、Der p に対する特異的な免疫グロブリン E (IgE) が陽性でした ( Pharmacia CAP System、Pharmacia Diagnostics、ウプサラ、スウェーデン）、少なくとも 0.7 kU/L の RAST 値。 喘息やアトピー性皮膚炎の既往歴のある子供は除外されました。 免疫療法を受けている子供は、年齢、性別、Der p に対する SPT 応答、総 IgE および Der p に対する特異的 IgE レベルについて、アトピー性ドナーと一致していました (表 1)。 研究プロトコルは、人間の研究のための機関審査委員会によって承認され、すべての被験者からインフォームドコンセントが得られました。

免疫療法プロトコル 皮下免疫療法を受けている子供には、以前に説明したクラスタープロトコルに従って、ヤケヒョウヒダニ抽出物 (Alutard SQ、ALK-Abello、Hørsholm、デンマーク) が与えられました [15]。 最初の 6 週間、小児は増量のための訪問を受け、1 時間間隔で 2 回の注射を受け、毎週用量を増やしました。 6 週目に与えられた最高濃度は、100,000 SQ/ml のアレルギー活性を有し、9.8 μg/ml Der p1 を含んでいました。 6 週目以降、投与間隔は 1 か月に延長され、最初の 1 年の終わりまで維持されました。 非 SIT グループに無作為に割り付けられた患者では、持続性鼻炎は、鼻腔内ステロイドおよび経口抗ヒスタミン薬を含む薬物療法で管理されました。 鼻腔内ステロイドは研究中同じ用量で維持され、必要に応じて抗ヒスタミン薬が使用されました。 血液サンプルは、両方のグループでベースライン時と 1 年間の治療後に採取されました。

臨床評価 AR 小児の症状は、鼻漏、くしゃみ、鼻づまり、鼻と眼のかゆみを含む合計 5 症状スコア (T5SS) によって評価されました。 各症状は、0 ～ 3 のスケール (0 = なし、3 = 重度) で採点されました。 薬の使用は、以前に説明したように、毎日採点され、記録されました [16]。 任意のスコアは、使用された薬剤に起因していました (鼻腔コルチコステロイドの 1 パフで 0.75 ポイント、抗ヒスタミン薬 1 錠で 1 ポイント)。 患者は、局所ステロイドのみを使用し（症状が改善しない場合は抗ヒスタミン薬も併用）、最初の薬物療法の各投与または変化を日記に報告するように指示されました。 患者はまた、採血の少なくとも 7 日前に薬物を中止するように指示されました。

フローサイトメトリー 静脈穿刺によって末梢血を採取し、防腐剤を含まないヘパリンに集めました。 末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Plaque Plus密度勾配遠心分離（Amersham Biosciences、NJ、USA）によって分離されました。 サイトカインの細胞内検出のために、PBMC (2 × 106 細胞/mL) を 10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, United Kingdom) で 24 時間刺激しました。 25 ng/mL ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート (PMA)、1 μg/mL イオノマイシン、および 1.7 μg/mL モネンシンを 37 °C で添加し、最後の 4 時間の刺激を行いました (すべてシグマ、ミズーリ州、米国から)。 .

フローサイトメトリーでは、抗 CD4-PerCP および抗 CD25-PE、またはアイソタイプ コントロール (マウス IgG1-PerCP または IgG1-PE) を使用して PBMC を室温で 20 分間表面染色しました (すべて米国カリフォルニア州ベックマン コールターから入手)。 . Foxp3の細胞内染色のために、細胞を固定し、Foxp3固定/透過処理バッファーで透過処理した後、抗ヒトFoxp3-FITCまたはアイソタイプコントロール（IgG1-FITC）で染色しました（すべてBioLegend、CA、USAから）。 細胞内サイトカイン分析のために、Der p1 刺激 PBMC を抗 CD3-APC および抗 CD8-PerCP で表面染色し、4% パラホルムアルデヒド/PBS で固定しました。 FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA) を使用して透過処理した後、細胞を抗 IL-4-PE と抗 IFN-γ-FITC、または抗 IL-10-PE とともに室温で 30 分間インキュベートしました。プラス抗IL-4-FITC、および各抗体は、コントロールとしてそれぞれのアイソタイプIgG1と一致しました（すべてBD Pharmingenから）。 次のように、詳細な表現型分析のために異なる T サブセットを選択しました。 (2) Th2 細胞: IL-4+IFN-γ-CD3+CD8- T 細胞。 （３）Ｔｒ１細胞：ＩＬ－１０＋ＩＬ－４－ＣＤ３＋ＣＤ８－Ｔ細胞。 各分析で、少なくとも 20,000 件のイベントが収集されました。 FACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences、NJ、USA）を使用して分析を実施しました。

ELISA PBMC を RPMI-1640 培地に 2 × 106 細胞/mL で再懸濁し、10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, United Kingdom) で刺激しました。 培養物は、5% CO2 を含む加湿インキュベーターで 37 ºC で 6 日間インキュベートしました。 アレルゲンで刺激された PBMC 培養物からの上清を、ELISA (R&D Systems、ミネアポリス、米国) によって IFN-γ、IL-4、および IL-10 の存在についてアッセイしました。

ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ Ｔｒｅｇ細胞の分離 細胞分離および機能分析のために、募集された８人のＳＩＴ処置子供および８人のＡＲ対照の各々からヘパリン化血液を得た。 PBMC 内の非 CD4+ 細胞をビオチン抗体カクテルと抗ビオチン マイクロビーズを含む LD カラムで除去した後、CD4+ T 細胞をネガティブ選択により PBMC から分離し、CD4+CD25+ T 細胞を CD4+ T 細胞からポジティブに選択しました。 最後に、メーカーの説明書 (Miltenyi Biotec、ドイツ) に従って、ヒト CD4+CD25+ 制御性 T 細胞分離キットを使用した MS-磁気カラムを使用して、CD25- 画分を回収しました。 最高の CD25 発現 (CD25high) を持つ細胞は、限られた量の抗 CD25 抗体ビーズ (2 μl の抗 CD25 ビーズ/107 細胞) とのインキュベーションによって選択されました [17]。 単離された CD4+ の平均純度は、Foxp3 陽性の CD4+ CD25high T 細胞では 95% (93-97%) および 76% (72-88%) でした。

ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ Ｔｒｅｇ細胞の抑制能力 ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ Ｔｒｅｇ細胞の抑制能力を評価するために、細胞増殖およびサイトカインを分析した。 CD4+CD25- T 細胞 (レスポンダー) のみ、または CD4+CD25- T 細胞と CD4+CD25high T 細胞 (サプレッサー) を 2:1 の比率で混合し、10 μg を含む 200 μl RPMI-1640 培地の最終容量で培養しました。 /ml Der p1. 培養物は、5% CO2 の加湿インキュベーターで 37 ºC で 6 日間インキュベートしました。 自己照射 PBMC (3000 rad) を抗原提示細胞として 2 × 105 で CD4+CD25- T 細胞培養物に添加しました。 すべての場合において、3 重の培地ウェルが陰性対照として含まれていました。 6 日目に、ELISA キット (R&D Systems、ミネアポリス、米国) を使用した Th1 および Th2 サイトカイン (IFN-γ および IL-4) 分析のために、100 μl の上清を除去しました。 次いで、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の細胞増殖を、ＷＳＴ−８（改変テトラゾリウム塩）細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎ、日本）を製造業者のプロトコルに従って使用して評価した。 増殖結果は、培地の450nmでの吸光度として表した。

統計 グループ間の統計的有意性は、マンホイットニー検定を使用して分析されました。 グループ内の治療前および治療後の変化の有意性は、ノンパラメトリックなウィルコクソンの対応ペア検定を使用して決定されました。 相関係数 r は、ピアソン相関を使用して生成されました。 すべての分析は、SPSS バージョン 13.0 統計ソフトウェアを使用して実行されました。 5% の有意水準 (α = 0.05) を使用し、検出力 (1-β) は 90% に相当します。 すべての検定は両側検定であり、0.05 未満の P 値は統計的に有意であると見なされました。