Wyraźna odpowiedź komórek regulatorowych T typu I CD4+CD25+Foxp3+ i IL-10 na immunoterapię swoistą dla klastrów u dzieci z alergicznym nieżytem nosa

Pacjenci Projekt był jednorocznym, randomizowanym, otwartym badaniem w grupach równoległych, w którym pacjentów przydzielono losowo w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej SIT z ekstraktem z Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dania) lub do obserwacji ze standardową farmakoterapią (grupa kontrolna).

W badaniu wzięło udział 50 dzieci z alergią na roztocza kurzu domowego (HDM) w wieku od 9 do 13 lat, które przez rok otrzymywały SIT z ekstraktem z Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). Porównano je z 21 dziećmi z alergią na HDM w wieku 9-14 lat, które służyły jako grupa kontrolna. Wszystkie dzieci były narodowości Han i zostały zwerbowane z kliniki alergologicznej szpitala Beijing TongRen. Mieli historię umiarkowanego lub ciężkiego nieżytu nosa i spojówek wywołanego przez HDM, trwającą co najmniej trzy lata. Każdy pacjent miał również dodatni wynik punktowego testu skórnego (SPT) dla Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Dania) z bąblem o średnicy co najmniej 6 mm i był dodatni dla swoistej immunoglobuliny E (IgE) dla Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Szwecja), z wartością RAST co najmniej 0,7 kU/L. Wykluczono dzieci z astmą lub atopowym zapaleniem skóry w wywiadzie. Dzieci poddane immunoterapii zostały dopasowane do dawców atopowych pod względem wieku, płci, odpowiedzi SPT na Der p, poziomu całkowitej IgE i swoistej IgE na Der p (Tabela 1). Protokół badania został zatwierdzony przez naszą instytucjonalną komisję odwoławczą do badań na ludziach i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich podmiotów.

Protokół immunoterapii Dzieciom poddawanym immunoterapii podskórnej podawano ekstrakt Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dania) zgodnie z protokołem klastrowym, który opisaliśmy wcześniej [15]. W ciągu pierwszych sześciu tygodni dzieci przechodziły wizyty w celu zwiększenia dawki, otrzymując dwa zastrzyki w odstępie jednej godziny, zwiększając dawkę co tydzień. Najwyższe stężenie, podane w szóstym tygodniu, miało aktywność alergiczną 100 000 SQ/ml i zawierało 9,8 μg/ml Der p1. Po szóstym tygodniu odstęp między dawkami zwiększono do jednego miesiąca i utrzymywano do końca pierwszego roku. W przypadku pacjentów przydzielonych losowo do grupy bez SIT, uporczywy nieżyt nosa leczono farmakoterapią, w tym sterydami donosowymi i doustnymi lekami przeciwhistaminowymi. Podczas badania sterydy donosowe utrzymywano w tej samej dawce, aw razie potrzeby stosowano leki przeciwhistaminowe. Próbki krwi pobrano na początku leczenia i po roku leczenia w obu grupach.

Ocena kliniczna Objawy u dzieci z AR oceniano na podstawie łącznej liczby 5 objawów (T5SS), która obejmuje wyciek z nosa, kichanie, przekrwienie błony śluzowej nosa oraz świąd nosa i oczu. Każdy objaw oceniano w skali 0-3 (0 = brak, 3 = ciężki). Stosowanie leków oceniano i rejestrowano codziennie, jak opisano wcześniej [16]. Zastosowanym lekom przypisywano arbitralne oceny (0,75 punktu za 1 dawkę kortykosteroidów donosowych i 1 punkt za 1 tabletkę leku przeciwhistaminowego). Pacjentów poinstruowano, aby stosowali wyłącznie miejscowe steroidy (plus leki przeciwhistaminowe, jeśli nie poprawiły one objawów) i zgłaszali w dzienniku każde podanie lub zmianę początkowej terapii lekowej. Pacjentów poinstruowano również, aby odstawili leki co najmniej 7 dni przed pobraniem krwi.

Cytometria przepływowa Krew obwodową uzyskano przez nakłucie żylne i zebrano do heparyny bez środków konserwujących. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, NJ, USA). W celu wewnątrzkomórkowego wykrycia cytokin, PBMC (2 x 106 komórek/ml) stymulowano 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Wielka Brytania) przez 24 godziny. Dodano 25 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), 1 μg/ml jonomycyny i 1,7 μg/ml monenzyny w temperaturze 37°C na ostatnie cztery godziny stymulacji (wszystkie z Sigma, Missouri, USA) .

Do cytometrii przepływowej PBMC barwiono powierzchniowo w temperaturze pokojowej przez 20 minut anty-CD4-PerCP i anty-CD25-PE lub kontrolą izotypową (mysie IgG1-PerCP lub IgG1-PE) (wszystkie z Beckman Coulter, CA, USA) . W celu barwienia wewnątrzkomórkowego Foxp3 komórki utrwalono i permeabilizowano buforem utrwalającym / permeabilizującym Foxp3, a następnie barwiono anty-ludzkim Foxp3-FITC lub kontrolą izotypową (IgG1-FITC) (wszystkie z BioLegend, Kalifornia, USA). Do analizy wewnątrzkomórkowych cytokin PBMC stymulowane Der p1 barwiono powierzchniowo anty-CD3-APC i anty-CD8-PerCP i utrwalano 4% paraformaldehydem/PBS. Po permeabilizacji za pomocą FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA), komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z anty-IL-4-PE plus anty-IFN-γ-FITC lub anty-IL-10-PE plus anty-IL-4-FITC, a każde przeciwciało dopasowano do odpowiedniego izotypu IgG1 jako kontroli (wszystkie z BD Pharmingen). Różne podzbiory T wybrano do szczegółowej analizy fenotypowej w następujący sposób: (1) komórki Th1: komórki T IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-; (2) komórki Th2: komórki T IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-; oraz (3) komórki Tr1: limfocyty T IL-10+IL-4-CD3+CD8-. Dla każdej analizy zebrano co najmniej 20 000 zdarzeń. Analizę przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC ponownie zawieszono w stężeniu 2 x 106 komórek/ml w pożywce RPMI-1640 i stymulowano 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Wielka Brytania). Hodowle inkubowano przez 6 dni w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% CO2. Supernatanty z hodowli PBMC stymulowanych alergenem badano na obecność IFN-γ, IL-4 i IL-10 za pomocą testu ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Izolacja komórek Treg CD4+CD25high Heparynizowaną krew uzyskano od każdego z ośmiu rekrutowanych dzieci leczonych SIT i ośmiu kontroli AR w celu izolacji komórek i analizy funkcjonalnej. Po usunięciu komórek innych niż CD4+ z PBMC przez kolumnę LD z koktajlem biotyna-przeciwciało i mikrokulkami antybiotyny, komórki T CD4+ wyizolowano z PBMC przez selekcję negatywną, a komórki T CD4+CD25+ wyselekcjonowano pozytywnie z komórek T CD4+. Ostatecznie, frakcje CD25- odzyskano stosując kolumnę magnetyczną MS, stosując zestaw do izolacji ludzkich regulatorowych komórek T CD4+CD25+ zgodnie z instrukcjami producenta (Miltenyi Biotec, Niemcy). Komórki o najwyższej ekspresji CD25 (CD25high) selekcjonowano poprzez inkubację z ograniczoną ilością perełek przeciwciał anty-CD25 (2 μl perełek anty-CD25/107 komórek) [17]. Średnia czystość wyizolowanego CD4+ wynosiła 95% (93-97%) i 76% (72-88%) dla komórek T CD4+CD25high, które były Foxp3-dodatnie.

Zdolność supresyjna komórek Treg CD4+CD25high W celu oceny zdolności supresyjnej komórek Treg CD4+CD25high, analizowano proliferację komórek i cytokiny. Limfocyty T CD4+CD25- (reagujące) same lub mieszane limfocyty T CD4+CD25- i limfocyty T CD4+CD25high (supresory) w stosunku 2:1 hodowano w końcowej objętości 200 µl pożywki RPMI-1640 z 10 µg /ml Der p1. Hodowle inkubowano przez 6 dni w 37 ºC w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2. Autologiczne napromieniowane PBMC (3000 rad) dodano w ilości 2 x 105 jako komórki prezentujące antygen do hodowli komórek T CD4+CD25-. We wszystkich przypadkach studzienki z pożywką w trzech powtórzeniach włączono jako kontrolę negatywną. Szóstego dnia pobrano 100 ul supernatantu do analizy cytokin Th1 i Th2 (IFN-γ i IL-4) za pomocą zestawu ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA). Proliferację komórek T CD4+CD25- oceniano następnie przy użyciu zestawu do proliferacji komórek WST-8 (zmodyfikowana sól tetrazoliowa) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japonia) zgodnie z protokołami producenta. Wynik proliferacji wyrażono jako absorbancję pożywki hodowlanej przy 450 nm.

Statystyki Istotność statystyczną między grupami analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya. Istotność zmian wewnątrzgrupowych przed i po terapii określono za pomocą nieparametrycznego testu par Wilcoxona. Współczynnik korelacji r został wygenerowany przy użyciu korelacji Pearsona. Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS w wersji 13.0. Zastosowano 5% poziom istotności (α = 0,05), moc (1- β) równą 90%. Wszystkie testy były dwustronne, a wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne.