Distinkt svar av CD4+CD25+Foxp3+ och IL-10-utsöndrande typ I T regulatoriska celler på klusterspecifik immunterapi hos barn med allergisk rinit

Patienter Designen var en ettårig, randomiserad öppen parallellgruppsstudie där patienter randomiserades i ett 1:1-förhållande för att få SIT med Dermatophagoides pteronyssinus-extrakt (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) eller för att observera med standardfarmakoterapi (kontrollgrupp).

Studiedeltagarna inkluderade 50 husdammskvalster (HDM)-allergiska barn i åldern 9-13, som fick SIT med Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) extrakt under ett år. Dessa jämfördes med 21 HDM-allergiska barn i åldrarna 9-14 som fungerade som kontroller. Alla barn var av Han-nationalitet och rekryterades från allergikliniken vid Beijing TongRen Hospital. De hade en historia av HDM-inducerad måttlig eller svår rhino-konjunktivit av minst tre års varaktighet. Varje patient hade också ett positivt hudpricktest (SPT) resultat för Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) med en snäckdiameter på minst 6 mm och var positiva för specifikt immunglobulin E (IgE) till Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sverige), med ett RAST-värde på minst 0,7 kU/L. Barn med astma eller atopisk dermatit i anamnesen exkluderades. Barnen som genomgick immunterapi matchades till atopiska donatorer för ålder, kön, SPT-svar på Der p, totalt IgE och specifika IgE till Der p-nivåer (tabell 1). Studieprotokollet godkändes av vår institutionella granskningsnämnd för humanstudier och informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner.

Immunterapiprotokoll Barn som genomgick subkutan immunterapi fick extrakt av Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Danmark) enligt ett klusterprotokoll som vi har beskrivit tidigare[15]. Under de första sex veckorna genomgick barn besök för uppdosering och fick två injektioner med en timmes mellanrum med ökande dos varje vecka. Den högsta koncentrationen, given under den sjätte veckan, hade en allergen aktivitet på 100 000 SQ/ml och innehöll 9,8 μg/ml Der p1. Efter vecka sex ökades doseringsintervallet till en månad och bibehölls till slutet av det första året. För patienter randomiserade till icke-SIT-grupp, hanterades persisterande rinit med farmakoterapi inklusive intranasala steroider och orala antihistaminer. Intranasala steroider hölls vid samma dos under studien och antihistaminer användes vid behov. Blodprover togs vid baslinjen och efter ett års behandling i båda grupperna.

Klinisk utvärdering Symtom på AR-barn bedömdes med Total 5 Symptom Score (T5SS), som inkluderar rinorré, nysningar, nästäppa och nasal och okulär klåda. Varje symptom bedömdes på en skala från 0-3 (0 = inget, 3 = allvarligt). Läkemedelsanvändning poängsattes och registrerades dagligen, som beskrivits tidigare [16]. Godtyckliga poäng tillskrevs de använda läkemedlen (0,75 poäng för 1 bloss av nasala kortikosteroider och 1 poäng för 1 tablett antihistamin). Patienterna instruerades att endast använda lokala steroider (plus antihistaminer om de inte förbättrade symtomen) och att rapportera varje administrering eller variation av den initiala läkemedelsbehandlingen i dagboken. Patienterna instruerades också att sluta med läkemedel minst 7 dagar före blodprovtagning.

Flödescytometri Perifert blod erhölls genom venpunktion och samlades upp i konserveringsmedelsfritt heparin. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) isolerades med hjälp av Ficoll-Plaque Plus densitetsgradientcentrifugering (Amersham Biosciences, NJ, USA). För intracellulär detektering av cytokin stimulerades PBMC (2 × 106 celler/ml) med 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannien) under 24 timmar. Tjugofem ng/mL forbol 12-myristat 13-acetat (PMA), 1 μg/mL jonomycin och 1,7 μg/mL monensine tillsattes vid 37 °C under de sista fyra timmarna av stimulering (alla från Sigma, Missouri, USA) .

För flödescytometri ytfärgades PBMC:er vid rumstemperatur i 20 minuter med anti-CD4-PerCP och anti-CD25-PE, eller isotypkontroll (mus IgG1-PerCP eller IgG1-PE) (alla från Beckman Coulter, CA, USA) . För intracellulär färgning av Foxp3 fixerades och permeabiliserades celler med Foxp3 fixerings-/permeabiliseringsbuffert, färgades sedan med anti-human Foxp3-FITC eller isotypkontroll (IgG1-FITC) (alla från BioLegend, CA, USA). För den intracellulära cytokinanalysen ytfärgades Der p1-stimulerade PBMC med anti-CD3-APC och anti-CD8-PerCP och fixerades med 4% paraformaldehyd/PBS. Efter att ha permeabiliserats med FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA), inkuberades celler i 30 minuter vid rumstemperatur med anti-IL-4-PE plus anti-IFN-y-FITC eller anti-IL-10-PE plus anti-IL-4-FITC, och varje antikropp matchades med en respektive isotyp IgG1 som kontroll (alla från BD Pharmingen). Olika T-undergrupper valdes ut för detaljerad fenotypisk analys enligt följande: (1) Thl-celler: IFN-y+IL-4-CD3+CD8-T-celler; (2) Th2-celler: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-celler; och (3) Trl-celler: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-celler. För varje analys samlades minst 20 000 händelser in. Analys utfördes med användning av en FACSCalibur flödescytometer (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC resuspenderades vid 2 × 106 celler/ml i RPMI-1640-medium och stimulerades med 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannien). Kulturer inkuberades i 6 dagar vid 37 ºC i en fuktad inkubator innehållande 5 % CO2. Supernatanter från allergenstimulerade PBMC-kulturer analyserades med avseende på närvaron av IFN-y, IL-4 och IL-10 med hjälp av ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Isolering av CD4+CD25hög Treg-celler Hepariniserat blod erhölls från vart och ett av åtta rekryterade SIT-behandlade barn och åtta AR-kontroller för cellisolering och funktionell analys. Efter att icke-CD4+-celler i PBMC-cellerna avlägsnats av LD-kolonn med en biotin-antikroppscocktail och antibiotikamikrokulor, isolerades CD4+ T-celler från PBMC genom negativ selektion och CD4+CD25+ T-celler selekterades positivt från CD4+ T-cellerna. Slutligen utvanns CD25-fraktioner med användning av en MS-magnetisk kolonn med användning av en human CD4+CD25+ regulatorisk T-cellisoleringskit enligt tillverkarens instruktioner (Miltenyi Biotec, Tyskland). Celler med det högsta CD25-uttrycket (CD25high) valdes ut genom inkubation med en begränsande mängd anti-CD25-antikroppspärlor (2 μl anti-CD25-pärlor/107 celler)[17]. Medelrenheten för den isolerade CD4+ var 95 % (93-97 %) och 76 % (72-88 %) för CD4+CD25-höga T-celler som var Foxp3-positiva.

Undertryckande kapacitet hos CD4+CD25hög Treg-celler För att utvärdera den undertryckande kapaciteten hos CD4+CD25hög Treg-celler analyserades cellproliferation och cytokin. CD4+CD25-T-celler (responders) ensamma eller blandade CD4+CD25-T-celler och CD4+CD25-höga T-celler (suppressorer) i ett förhållande av 2:1 odlades i en slutlig volym av 200 µl RPMI-1640-medium med 10 µg /ml Der pl. Kulturer inkuberades i 6 dagar vid 37 ºC i en fuktad inkubator med 5 % CO2. Autologa bestrålade PBMC (3000 rad) tillsattes vid 2 × 105 som antigenpresenterande celler till CD4+CD25-T-cellkulturer. I alla fall inkluderades trippelmediumbrunnar som negativa kontroller. På dag sex avlägsnades 100 µl supernatant för Th1- och Th2-cytokinanalys (IFN-y och IL-4) med ett ELISA-kit (R&D Systems, Minneapolis, USA). Cellproliferation av CD4+CD25-T-celler utvärderades sedan med användning av ett WST-8 (modifierat tetrazoliumsalt) cellproliferationskit (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) enligt tillverkarnas protokoll. Proliferationsresultatet uttrycktes som absorbans vid 450 nm av odlingsmediet.

Statistik Statistisk signifikans mellan grupper analyserades med ett Mann-Whitney-test. Betydelsen av förändringar i gruppen före och efter behandlingen bestämdes med hjälp av ett icke-parametriskt Wilcoxon matchade par-test. Korrelationskoefficienten r genererades med användning av Pearson-korrelationen. Alla analyser utfördes med hjälp av SPSS version 13.0 statistisk programvara. En 5% signifikansnivå användes (α = 0,05), effekt (1-β) lika med 90%. Alla tester var tvåsidiga och P-värden på mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.