Risposta distinta delle cellule regolatorie di tipo I T secernenti CD4 + CD25 + Foxp3 + e IL-10 all'immunoterapia specifica per cluster nei bambini con rinite allergica

Pazienti Il progetto era uno studio randomizzato in aperto a gruppi paralleli della durata di un anno in cui i pazienti sono stati randomizzati in un rapporto 1:1 per ricevere SIT con estratto di Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Danimarca) o per osservare con farmacoterapia standard (gruppo di controllo).

I partecipanti allo studio includevano 50 bambini allergici agli acari della polvere domestica (HDM) di età compresa tra 9 e 13 anni, che hanno ricevuto SIT con estratto di Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) per un anno. Questi sono stati confrontati con 21 bambini HDM-allergici di età compresa tra 9 e 14 anni che fungevano da controllo. Tutti i bambini erano di nazionalità Han e sono stati reclutati dalla clinica allergica dell'ospedale TongRen di Pechino. Avevano una storia di rinocongiuntivite moderata o grave indotta da HDM della durata di almeno tre anni. Ogni paziente presentava anche un risultato positivo al prick test cutaneo (SPT) per Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Danimarca) con un diametro del pomfo di almeno 6 mm ed era positivo per l'immunoglobulina E specifica (IgE) per Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Svezia), con un valore RAST di almeno 0,7 kU/L. Sono stati esclusi i bambini con una storia di asma o dermatite atopica. I bambini sottoposti a immunoterapia sono stati abbinati a donatori atopici per età, sesso, risposta SPT a Der p, IgE totali e IgE specifiche a Der p (Tabella 1). Il protocollo di studio è stato approvato dal nostro comitato di revisione istituzionale per gli studi sull'uomo e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti.

Protocollo di immunoterapia Ai bambini sottoposti a immunoterapia sottocutanea è stato somministrato l'estratto di Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Danimarca) secondo un protocollo cluster che abbiamo descritto in precedenza[15]. Nelle prime sei settimane, i bambini sono stati sottoposti a visite per l'aumento del dosaggio, ricevendo due iniezioni a distanza di un'ora con una dose crescente ogni settimana. La concentrazione più alta, data nella sesta settimana, aveva un'attività allergenica di 100.000 SQ/ml e conteneva 9,8 μg/ml Der p1. Dopo la sesta settimana, l'intervallo tra le somministrazioni è stato aumentato a un mese e mantenuto fino alla fine del primo anno. Per i pazienti randomizzati al gruppo non-ITS, la rinite persistente è stata gestita con una terapia farmacologica comprendente steroidi intranasali e antistaminici orali. Gli steroidi intranasali sono stati mantenuti alla stessa dose durante lo studio e gli antistaminici sono stati utilizzati secondo necessità. I campioni di sangue sono stati prelevati al basale e dopo un anno di trattamento in entrambi i gruppi.

Valutazione clinica I sintomi dei bambini AR sono stati valutati mediante il Total 5 Symptom Score (T5SS), che include rinorrea, starnuti, congestione nasale e prurito nasale e oculare. Ogni sintomo è stato valutato su una scala da 0 a 3 (0 = nessuno, 3 = grave). L'uso di farmaci è stato valutato e registrato giornalmente, come descritto in precedenza [16]. Ai farmaci utilizzati sono stati attribuiti punteggi arbitrari (0,75 punti per 1 puff di corticosteroidi nasali e 1 punto per 1 compressa di antistaminico). I pazienti sono stati istruiti a utilizzare solo steroidi locali (più antistaminici se non miglioravano i sintomi) e a riportare nel diario ogni somministrazione o variazione della terapia farmacologica iniziale. I pazienti sono stati anche istruiti a interrompere i farmaci almeno 7 giorni prima del prelievo di sangue.

Citometria a flusso Il sangue periferico è stato ottenuto mediante puntura venosa e raccolto in eparina priva di conservanti. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, NJ, USA). Per il rilevamento intracellulare delle citochine, le PBMC (2 × 106 cellule/mL) sono state stimolate con 10 μg/mL di Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Regno Unito) per 24 ore. Venticinque ng/mL di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), 1 μg/mL di ionomicina e 1,7 μg/mL di monensina sono stati aggiunti a 37 °C per le ultime quattro ore di stimolazione (tutti da Sigma, Missouri, USA) .

Per la citometria a flusso, le PBMC sono state colorate in superficie a temperatura ambiente per 20 minuti con anti-CD4-PerCP e anti-CD25-PE o controllo isotipico (topo IgG1-PerCP o IgG1-PE) (tutti da Beckman Coulter, CA, USA) . Per la colorazione intracellulare di Foxp3, le cellule sono state fissate e permeabilizzate con tampone di fissazione/permeabilizzazione Foxp3, quindi colorate con Foxp3-FITC anti-umano o controllo isotipico (IgG1-FITC) (tutti da BioLegend, CA, USA). Per l'analisi delle citochine intracellulari, i PBMC stimolati da Der p1 sono stati colorati in superficie con anti-CD3-APC e anti-CD8-PerCP e fissati con paraformaldeide al 4%/PBS. Dopo essere state permeabilizzate utilizzando la soluzione permeabilizzante FACS (BD Pharmingen, CA, USA), le cellule sono state incubate per 30 minuti a temperatura ambiente con anti-IL-4-PE più anti-IFN-γ-FITC o anti-IL-10-PE più anti-IL-4-FITC e ciascun anticorpo è stato abbinato a un rispettivo isotipo IgG1 come controllo (tutti da BD Pharmingen). Diversi sottogruppi T sono stati selezionati per un'analisi fenotipica dettagliata come segue: (1) cellule Th1: cellule T IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-; (2) cellule Th2: cellule T IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-; e (3) cellule Tr1: cellule IL-10+IL-4-CD3+CD8-T. Per ogni analisi sono stati raccolti almeno 20.000 eventi. L'analisi è stata condotta utilizzando un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, USA).

I PBMC ELISA sono stati risospesi a 2 × 106 cellule/mL in terreno RPMI-1640 e stimolati con 10 μg/mL di Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Regno Unito). Le colture sono state incubate per 6 giorni a 37 ºC in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO2. I supernatanti delle colture di PBMC stimolate da allergeni sono stati analizzati per la presenza di IFN-γ, IL-4 e IL-10 mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Isolamento di cellule Treg CD4 + CD25 alte Il sangue eparinizzato è stato ottenuto da ciascuno degli otto bambini reclutati trattati con SIT e otto controlli AR per l'isolamento cellulare e l'analisi funzionale. Dopo che le cellule non CD4+ nelle PBMC sono state rimosse dalla colonna LD con un cocktail di biotina-anticorpo e microsfere di antibiotina, le cellule T CD4+ sono state isolate dalle PBMC mediante selezione negativa e le cellule T CD4+CD25+ sono state selezionate positivamente dalle cellule T CD4+. Infine, le frazioni CD25- sono state recuperate utilizzando una colonna magnetica MS utilizzando un kit di isolamento delle cellule T regolatorie CD4 + CD25 + umano secondo le istruzioni del produttore (Miltenyi Biotec, Germania). Le cellule con la più alta espressione di CD25 (CD25high) sono state selezionate mediante incubazione con una quantità limitata di microsfere di anticorpi anti-CD25 (2 μl di microsfere anti-CD25/107 cellule)[17]. La purezza media del CD4+ isolato era del 95% (93-97%) e del 76% (72-88%) per le cellule T CD4+CD25high che erano positive per Foxp3.

Capacità soppressiva delle cellule Treg CD4+CD25high Per valutare la capacità soppressiva delle cellule Treg CD4+CD25high, sono state analizzate la proliferazione cellulare e le citochine. Cellule T CD4+CD25- (responder) da sole o miste Cellule T CD4+CD25- e cellule T CD4+CD25high (soppressori) con un rapporto di 2:1 sono state coltivate in un volume finale di 200 µl di terreno RPMI-1640 con 10 µg /ml der p1. Le colture sono state incubate per 6 giorni a 37 ºC in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. PBMC autologhe irradiate (3000 rad) sono state aggiunte a 2 × 105 come cellule presentanti l'antigene a colture di cellule T CD4+CD25-. In tutti i casi, come controlli negativi sono stati inclusi pozzetti di terreno in triplicato. Al sesto giorno, 100 µl di surnatante sono stati rimossi per l'analisi delle citochine Th1 e Th2 (IFN-γ e IL-4) con un kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA). La proliferazione cellulare delle cellule T CD4+CD25- è stata quindi valutata utilizzando un kit di proliferazione cellulare WST-8 (sale di tetrazolio modificato) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Giappone) secondo i protocolli dei produttori. Il risultato della proliferazione è stato espresso come assorbanza a 450 nm del terreno di coltura.

Statistiche La significatività statistica tra i gruppi è stata analizzata utilizzando un test di Mann-Whitney. Il significato dei cambiamenti intra-gruppo pre e post terapia è stato determinato utilizzando un test di coppie appaiate Wilcoxon non parametrico. Il coefficiente di correlazione r è stato generato utilizzando la correlazione di Pearson. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando il software statistico SPSS versione 13.0. È stato utilizzato un livello di significatività del 5% (α = 0,05), potenza (1-β) pari al 90%. Tutti i test erano a 2 code e i valori P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.