Distinkt respons af CD4+CD25+Foxp3+ og IL-10-udskillende type I T regulatoriske celler på klyngespecifik immunterapi hos børn med allergisk rhinitis

Patienter Designet var et etårigt, randomiseret åbent parallelgruppestudie, hvor patienter blev randomiseret i et 1:1-forhold til at modtage SIT med Dermatophagoides pteronyssinus-ekstrakt (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) eller for at observere med standard farmakoterapi (kontrolgruppe).

Deltagerne i undersøgelsen inkluderede 50 husstøvmider (HDM)-allergiske børn i alderen 9-13, som fik SIT med Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) ekstrakt i et år. Disse blev sammenlignet med 21 HDM-allergiske børn i alderen 9-14, der fungerede som kontroller. Alle børn var af Han-nationalitet og blev rekrutteret fra allergiklinikken på Beijing TongRen Hospital. De havde en historie med HDM-induceret moderat eller svær rhino-konjunktivitis af mindst tre års varighed. Hver patient havde også et positivt hudprik-test (SPT) resultat for Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Danmark) med en keglediameter på mindst 6 mm og var positiv for specifikt immunglobulin E (IgE) til Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sverige), med en RAST-værdi på mindst 0,7 kU/L. Børn med en historie med astma eller atopisk dermatitis blev udelukket. De børn, der gennemgår immunterapi, blev matchet med atopiske donorer for alder, køn, SPT-respons på Der p, total IgE og specifikke IgE til Der p-niveauer (tabel 1). Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af vores institutionelle revisionsudvalg for humane undersøgelser, og informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner.

Immunterapiprotokol Børn, der gennemgår subkutan immunterapi, fik Dermatophagoides pteronyssinus-ekstrakt (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Danmark) i henhold til en klyngeprotokol, som vi har beskrevet tidligere[15]. I de første seks uger gennemgik børn besøg for opdosering, idet de fik to injektioner med en times mellemrum med en stigende dosis hver uge. Den højeste koncentration, givet i den sjette uge, havde en allergifremkaldende aktivitet på 100.000 SQ/ml og indeholdt 9,8 μg/ml Der p1. Efter uge seks blev doseringsintervallet øget til en måned og opretholdt indtil slutningen af ​​det første år. For patienter randomiseret til ikke-SIT-gruppe blev vedvarende rhinitis behandlet med farmakoterapi, herunder intranasale steroider og orale antihistaminer. Intranasale steroider blev holdt i samme dosis under undersøgelsen, og antihistaminer blev brugt efter behov. Blodprøver blev taget ved baseline og efter et års behandling i begge grupper.

Klinisk evaluering Symptomer på AR-børn blev vurderet ved Total 5 Symptom Score (T5SS), som inkluderer rhinoré, nysen, tilstoppet næse og nasal og okulær kløe. Hvert symptom blev scoret på en skala fra 0-3 (0 = ingen, 3 = alvorlig). Medicinbrug blev scoret og registreret dagligt, som beskrevet tidligere [16]. Vilkårlige resultater blev tilskrevet de anvendte lægemidler (0,75 point for 1 pust af nasale kortikosteroider og 1 point for 1 tablet antihistamin). Patienterne blev instrueret i kun at bruge lokale steroider (plus antihistaminer, hvis de ikke forbedrede symptomerne) og at rapportere hver administration eller variation af den indledende lægemiddelbehandling i dagbogen. Patienterne blev også instrueret i at stoppe medicin mindst 7 dage før blodprøvetagning.

Flowcytometri Perifert blod blev opnået ved venepunktur og opsamlet i konserveringsmiddelfrit heparin. Perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) blev isoleret ved hjælp af Ficoll-Plaque Plus densitetsgradientcentrifugering (Amersham Biosciences, NJ, USA). Til intracellulær påvisning af cytokin blev PBMC'er (2 × 106 celler/mL) stimuleret med 10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannien) i 24 timer. Femogtyve ng/mL phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), 1 μg/mL ionomycin og 1,7 μg/mL monensine blev tilsat ved 37 °C i de sidste fire timers stimulering (alle fra Sigma, Missouri, USA) .

Til flowcytometri blev PBMC'er overfladefarvet ved stuetemperatur i 20 minutter med anti-CD4-PerCP og anti-CD25-PE eller isotypekontrol (muse-IgG1-PerCP eller IgG1-PE) (alle fra Beckman Coulter, CA, USA) . Til intracellulær farvning af Foxp3 blev celler fikseret og permeabiliseret med Foxp3 fikserings-/permeabiliseringsbuffer, derefter farvet med anti-human Foxp3-FITC eller isotypekontrol (IgG1-FITC) (alle fra BioLegend, CA, USA). Til den intracellulære cytokinanalyse blev Der p1-stimulerede PBMC'er overfladefarvet med anti-CD3-APC og anti-CD8-PerCP og fikseret med 4% paraformaldehyd/PBS. Efter at være blevet permeabiliseret ved hjælp af FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA), blev celler inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med anti-IL-4-PE plus anti-IFN-γ-FITC eller anti-IL-10-PE plus anti-IL-4-FITC, og hvert antistof blev matchet med en respektive isotype IgG1 som kontrol (alle fra BD Pharmingen). Forskellige T-undersæt blev udvalgt til detaljeret fænotypisk analyse som følger: (1) Th1-celler: IFN-y+IL-4-CD3+CD8-T-celler; (2) Th2-celler: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-celler; og (3) Tr1-celler: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-celler. For hver analyse blev der indsamlet mindst 20.000 hændelser. Analyse blev udført ved anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC'er blev resuspenderet ved 2 × 106 celler/mL i RPMI-1640-medium og stimuleret med 10 μg/mL Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Storbritannien). Kulturer blev inkuberet i 6 dage ved 37 ºC i en fugtig inkubator indeholdende 5 % CO2. Supernatanter fra allergen-stimulerede PBMCs-kulturer blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​IFN-y, IL-4 og IL-10 ved hjælp af ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Isolering af CD4+CD25-høj Treg-celler Hepariniseret blod blev opnået fra hver af otte rekrutterede SIT-behandlede børn og otte AR-kontroller til celleisolering og funktionel analyse. Efter at ikke-CD4+-celler i PBMC'erne blev fjernet ved hjælp af LD-søjle med en biotin-antistofcocktail og antibiotinmikroperler, blev CD4+ T-celler isoleret fra PBMC'erne ved negativ selektion, og CD4+CD25+ T-celler blev positivt udvalgt fra CD4+ T-cellerne. Til sidst blev CD25-fraktioner udvundet under anvendelse af en MS-magnetisk søjle under anvendelse af et humant CD4+CD25+ regulatorisk T-celleisoleringskit i henhold til producentens instruktioner (Miltenyi Biotec, Tyskland). Celler med den højeste CD25-ekspression (CD25-høj) blev udvalgt gennem inkubation med en begrænsende mængde anti-CD25-antistofperler (2 μl anti-CD25-perler/107-celler)[17]. Den gennemsnitlige renhed af det isolerede CD4+ var 95% (93-97%) og 76% (72-88%) for CD4+CD25-høj T-celler, der var Foxp3-positive.

Undertrykkende kapacitet af CD4+CD25-høj Treg-celler For at evaluere den undertrykkende kapacitet af CD4+CD25-høj-Treg-celler blev celleproliferation og cytokin analyseret. CD4+CD25-T-celler (respondere) alene eller blandede CD4+CD25-T-celler og CD4+CD25-høje T-celler (suppressorer) i et forhold på 2:1 blev dyrket i et slutvolumen på 200 µl RPMI-1640-medium med 10 µg /ml Der p1. Kulturer blev inkuberet i 6 dage ved 37 ºC i en fugtig inkubator med 5 % CO2. Autologe bestrålede PBMC'er (3000 rad) blev tilsat ved 2 x 105 som antigen-præsenterende celler til CD4+CD25-T-cellekulturer. I alle tilfælde blev tredobbelte mediumbrønde inkluderet som negative kontroller. På dag seks blev 100 µl supernatant fjernet til Th1- og Th2-cytokin (IFN-y og IL-4)-analyse med et ELISA-kit (R&D Systems, Minneapolis, USA). Celleproliferation af CD4+CD25-T-celler blev derefter vurderet under anvendelse af et WST-8 (modificeret tetrazoliumsalt) celleproliferationskit (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) i henhold til producentens protokoller. Proliferationsresultatet blev udtrykt som absorbans ved 450 nm af dyrkningsmediet.

Statistik Statistisk signifikans mellem grupper blev analyseret ved hjælp af en Mann-Whitney test. Betydningen af ​​intra-gruppe ændringer før og efter behandling blev bestemt ved hjælp af en ikke-parametrisk Wilcoxon matchede par test. Korrelationskoefficienten r blev genereret ved hjælp af Pearson-korrelationen. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS version 13.0 statistisk software. Et signifikansniveau på 5 % blev brugt (α = 0,05), effekt (1-β) lig med 90 %. Alle tests var 2-halede, og P-værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.