Duidelijke respons van CD4+CD25+Foxp3+ en IL-10-uitscheidende type I T regulerende cellen op clusterspecifieke immunotherapie bij kinderen met allergische rhinitis

Patiënten De opzet was een eenjarige, gerandomiseerde open-label studie met parallelle groepen waarin patiënten werden gerandomiseerd in een verhouding van 1:1 om SIT met Dermatophagoides pteronyssinus-extract (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Denemarken) te krijgen of om met standaard farmacotherapie (controlegroep).

Onder de studiedeelnemers bevonden zich 50 huisstofmijt (HDM)-allergische kinderen van 9-13 jaar, die SIT met Dermatophagoides pteronyssinus (Der p)-extract gedurende een jaar kregen. Deze werden vergeleken met 21 HDM-allergische kinderen van 9-14 jaar die als controlegroep dienden. Alle kinderen hadden de Han-nationaliteit en werden gerekruteerd uit de allergiekliniek van het Beijing TongRen Hospital. Ze hadden een voorgeschiedenis van door HDM veroorzaakte matige of ernstige rhinoconjunctivitis van ten minste drie jaar. Elke patiënt had ook een positief resultaat van de huidpriktest (SPT) voor Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Denemarken) met een kwaddeldiameter van ten minste 6 mm, en was positief voor specifiek immunoglobuline E (IgE) voor Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Zweden), met een RAST-waarde van ten minste 0,7 kU/L. Kinderen met een voorgeschiedenis van astma of atopische dermatitis werden uitgesloten. De kinderen die immunotherapie ondergingen, werden gematcht met atopische donoren wat betreft leeftijd, geslacht, SPT-respons op Der p, totaal IgE en specifiek IgE op Der p-niveaus (Tabel 1). Het studieprotocol werd goedgekeurd door onze institutionele beoordelingsraad voor studies bij mensen en er werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen.

Immunotherapieprotocol Kinderen die subcutane immunotherapie ondergingen, kregen Dermatophagoides pteronyssinus-extract (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Denemarken) volgens een eerder beschreven clusterprotocol [15]. In de eerste zes weken ondergingen de kinderen bezoeken voor het verhogen van de dosis, waarbij ze twee injecties kregen met een tussenpoos van een uur met een toenemende dosis elke week. De hoogste concentratie, gegeven in de zesde week, had een allergene activiteit van 100.000 SQ/ml en bevatte 9,8 μg/ml Der p1. Na week zes werd het doseringsinterval verlengd tot één maand en gehandhaafd tot het einde van het eerste jaar. Voor patiënten gerandomiseerd naar niet-SIT-groep werd aanhoudende rhinitis behandeld met farmacotherapie waaronder intranasale steroïden en orale antihistaminica. Tijdens het onderzoek werden intranasale steroïden in dezelfde dosis gehouden en indien nodig werden antihistaminica gebruikt. In beide groepen werden bloedmonsters genomen bij aanvang en na een jaar behandeling.

Klinische evaluatie Symptomen van AR-kinderen werden beoordeeld aan de hand van de Total 5 Symptom Score (T5SS), waaronder rinorroe, niezen, verstopte neus en neus- en oogpruritus. Elk symptoom werd gescoord op een schaal van 0-3 (0 = geen, 3 = ernstig). Medicatiegebruik werd dagelijks gescoord en geregistreerd, zoals eerder beschreven [16]. Willekeurige scores werden toegekend aan de gebruikte medicijnen (0,75 punt voor 1 pufje nasale corticosteroïden en 1 punt voor 1 tablet antihistaminicum). Patiënten kregen de instructie om alleen lokale steroïden te gebruiken (plus antihistaminica als ze de symptomen niet verbeterden) en om elke toediening of variatie van de initiële medicamenteuze therapie in het dagboek te rapporteren. Patiënten kregen ook de instructie om ten minste 7 dagen vóór bloedafname te stoppen met het gebruik van medicijnen.

Flowcytometrie Perifeer bloed werd verkregen door veneuze punctie en opgevangen in conserveermiddelvrije heparine. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden geïsoleerd door middel van Ficoll-Plaque Plus dichtheidsgradiëntcentrifugatie (Amersham Biosciences, NJ, VS). Voor intracellulaire detectie van cytokine werden PBMC's (2 x 106 cellen / ml) gedurende 24 uur gestimuleerd met 10 μg / ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergeen 1, Indoor Biotechnologies, Verenigd Koninkrijk). Vijfentwintig ng / ml forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), 1 μg / ml ionomycine en 1, 7 μg / ml monensine werden toegevoegd bij 37 ° C voor de laatste vier uur van stimulatie (allemaal van Sigma, Missouri, VS) .

Voor flowcytometrie werden PBMC's gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur aan het oppervlak gekleurd met anti-CD4-PerCP en anti-CD25-PE, of isotypecontrole (muis IgG1-PerCP of IgG1-PE) (allemaal van Beckman Coulter, CA, VS) . Voor intracellulaire kleuring van Foxp3 werden cellen gefixeerd en permeabel gemaakt met Foxp3 fixatie / permeabilisatiebuffer, vervolgens gekleurd met anti-menselijke Foxp3-FITC of isotypecontrole (IgG1-FITC) (allemaal van BioLegend, CA, VS). Voor de intracellulaire cytokine-analyse werden door Der p1 gestimuleerde PBMC's aan het oppervlak gekleurd met anti-CD3-APC en anti-CD8-PerCP en gefixeerd met 4% paraformaldehyde/PBS. Na te zijn gepermeabiliseerd met behulp van FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, VS), werden de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-IL-4-PE plus anti-IFN-γ-FITC of anti-IL-10-PE plus anti-IL-4-FITC, en elk antilichaam werd gematcht met een respectievelijk isotype IgG1 als controle (allemaal van BD Pharmingen). Verschillende T-subsets werden als volgt geselecteerd voor gedetailleerde fenotypische analyse: (1) Th1-cellen: IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-T-cellen; (2) Th2-cellen: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-cellen; en (3) Tr1-cellen: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-cellen. Voor elke analyse werden ten minste 20.000 gebeurtenissen verzameld. Analyse werd uitgevoerd met behulp van een FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, NJ, VS).

ELISA PBMC's werden opnieuw gesuspendeerd bij 2 x 106 cellen / ml in RPMI-1640-medium en gestimuleerd met 10 μg / ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergeen 1, Indoor Biotechnologies, Verenigd Koninkrijk). Kweken werden gedurende 6 dagen bij 37°C geïncubeerd in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Supernatanten van door allergeen gestimuleerde PBMC-culturen werden getest op de aanwezigheid van IFN-y, IL-4 en IL-10 door middel van ELISA (R&D Systems, Minneapolis, VS).

Isolatie van CD4+CD25high Treg-cellen Gehepariniseerd bloed werd verkregen van elk van de acht aangeworven met SIT behandelde kinderen en acht AR-controles voor celisolatie en functionele analyse. Nadat niet-CD4+-cellen in de PBMC's waren verwijderd door middel van een LD-kolom met een biotine-antilichaamcocktail en antibiotinemicrobeads, werden CD4+ T-cellen geïsoleerd uit de PBMC's door negatieve selectie, en CD4+CD25+ T-cellen werden positief geselecteerd uit de CD4+ T-cellen. Ten slotte werden CD25-fracties teruggewonnen met behulp van een MS-magnetische kolom met behulp van een menselijke CD4+CD25+ regulerende T-celisolatiekit volgens de instructies van de fabrikant (Miltenyi Biotec, Duitsland). Cellen met de hoogste CD25-expressie (CD25high) werden geselecteerd door incubatie met een beperkte hoeveelheid anti-CD25-antilichaamparels (2 μl anti-CD25-parels/107 cellen) [17]. De gemiddelde zuiverheid van de geïsoleerde CD4+ was 95% (93-97%) en 76% (72-88%) voor CD4+CD25 hoge T-cellen die Foxp3-positief zijn.

Suppressieve capaciteit van CD4+CD25 high Treg-cellen Om de suppressieve capaciteit van CD4+CD25 high Treg-cellen te evalueren, werden celproliferatie en cytokine geanalyseerd. CD4+CD25-T-cellen (responders) alleen of gemengde CD4+CD25-T-cellen en CD4+CD25 hoge T-cellen (suppressors) in een verhouding van 2:1 werden gekweekt in een uiteindelijk volume van 200 µl RPMI-1640 medium met 10 µg /ml Der p1. Kweken werden 6 dagen bij 37°C geïncubeerd in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Autologe bestraalde PBMC's (3000 rad) werden toegevoegd bij 2 x 105 als antigeenpresenterende cellen aan CD4+CD25-T-celkweken. In alle gevallen werden mediumputjes in drievoud opgenomen als negatieve controles. Op dag zes werd 100 µl supernatant verwijderd voor Th1- en Th2-cytokine-analyse (IFN-y en IL-4) met een ELISA-kit (R&D Systems, Minneapolis, VS). Celproliferatie van CD4 + CD25-T-cellen werd vervolgens beoordeeld met behulp van een WST-8 (gemodificeerd tetrazoliumzout) celproliferatiekit (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) volgens de protocollen van de fabrikant. Het proliferatieresultaat werd uitgedrukt als absorptie bij 450 nm van het kweekmedium.

Statistieken Statistische significantie tussen groepen werd geanalyseerd met behulp van een Mann-Whitney-test. De significantie van veranderingen binnen de groep vóór en na de therapie werd bepaald met behulp van een niet-parametrische Wilcoxon-matched pairs-test. De correlatiecoëfficiënt r werd gegenereerd met behulp van de Pearson-correlatie. Alle analyses zijn uitgevoerd met SPSS versie 13.0 statistische software. Er werd een significantieniveau van 5% gebruikt (α = 0,05), power (1-β) gelijk aan 90%. Alle tests waren tweezijdig en P-waarden van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.