Réponse distincte des cellules régulatrices de type I T sécrétant CD4 + CD25 + Foxp3 + et IL-10 à l'immunothérapie spécifique du cluster chez les enfants atteints de rhinite allergique

Patients La conception était une étude randomisée ouverte en groupes parallèles d'un an dans laquelle les patients étaient randomisés selon un rapport 1:1 pour recevoir une ITS avec de l'extrait de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Danemark) ou pour observer avec une pharmacothérapie standard (groupe témoin).

Les participants à l'étude comprenaient 50 enfants allergiques aux acariens (HDM) âgés de 9 à 13 ans, qui ont reçu une ITS avec un extrait de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) pendant un an. Ceux-ci ont été comparés à 21 enfants allergiques au HDM âgés de 9 à 14 ans qui ont servi de témoins. Tous les enfants étaient de nationalité Han et ont été recrutés à la clinique d'allergie de l'hôpital TongRen de Pékin. Ils avaient des antécédents de rhino-conjonctivite modérée ou sévère induite par HDM depuis au moins trois ans. Chaque patient avait également un résultat positif au test cutané (SPT) pour Der p (ALK-Abello ', Hørsholm, Danemark) avec un diamètre de papule d'au moins 6 mm, et était positif pour l'immunoglobuline E spécifique (IgE) contre Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suède), avec une valeur RAST d'au moins 0,7 kU/L. Les enfants ayant des antécédents d'asthme ou de dermatite atopique ont été exclus. Les enfants subissant une immunothérapie ont été appariés à des donneurs atopiques pour l'âge, le sexe, la réponse SPT à Der p, les taux d'IgE totales et d'IgE spécifiques à Der p (tableau 1). Le protocole d'étude a été approuvé par notre comité d'examen institutionnel pour les études humaines et le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets.

Protocole d'immunothérapie Les enfants subissant une immunothérapie sous-cutanée ont reçu de l'extrait de Dermatophagoides pteronyssinus (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Danemark) selon un protocole de cluster que nous avons décrit précédemment [15]. Au cours des six premières semaines, les enfants ont subi des visites pour une augmentation de la dose, recevant deux injections à une heure d'intervalle avec une dose croissante chaque semaine. La concentration la plus élevée, administrée à la sixième semaine, avait une activité allergène de 100 000 SQ/ml et contenait 9,8 μg/ml de Der p1. Après la sixième semaine, l'intervalle de dosage a été porté à un mois et maintenu jusqu'à la fin de la première année. Pour les patients randomisés dans le groupe sans ITS, la rhinite persistante a été prise en charge par une pharmacothérapie comprenant des stéroïdes intranasaux et des antihistaminiques oraux. Les stéroïdes intranasaux ont été maintenus à la même dose pendant l'étude et les antihistaminiques ont été utilisés au besoin. Des échantillons de sang ont été prélevés au départ et après un an de traitement dans les deux groupes.

Évaluation clinique Les symptômes des enfants atteints de RA ont été évalués par le score total des 5 symptômes (T5SS), qui comprend la rhinorrhée, les éternuements, la congestion nasale et le prurit nasal et oculaire. Chaque symptôme a été noté sur une échelle de 0 à 3 (0 = aucun, 3 = sévère). La consommation de médicaments a été notée et enregistrée quotidiennement, comme décrit précédemment [16]. Des scores arbitraires ont été attribués aux médicaments utilisés (0,75 point pour 1 bouffée de corticoïdes nasaux et 1 point pour 1 comprimé d'antihistaminique). Les patients ont reçu pour instruction de n'utiliser que des stéroïdes locaux (plus des antihistaminiques s'ils n'amélioraient pas les symptômes) et de signaler chaque administration ou modification du traitement médicamenteux initial dans le journal. Les patients ont également reçu pour instruction d'arrêter les médicaments au moins 7 jours avant le prélèvement sanguin.

Cytométrie en flux Le sang périphérique a été obtenu par ponction veineuse et recueilli dans de l'héparine sans conservateur. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées au moyen d'une centrifugation en gradient de densité Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences, NJ, USA). Pour la détection intracellulaire de la cytokine, les PBMC (2 × 106 cellules/mL) ont été stimulées avec 10 μg/mL de Der p1 (allergène majeur D. pteronyssinus 1, Indoor Biotechnologies, Royaume-Uni) pendant 24 heures. Vingt-cinq ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), 1 μg/mL d'ionomycine et 1,7 μg/mL de monensine ont été ajoutés à 37 °C pendant les quatre dernières heures de stimulation (tous de Sigma, Missouri, États-Unis) .

Pour la cytométrie en flux, les PBMC ont été colorées en surface à température ambiante pendant 20 minutes avec des anti-CD4-PerCP et anti-CD25-PE, ou un contrôle d'isotype (souris IgG1-PerCP ou IgG1-PE) (tous de Beckman Coulter, CA, USA) . Pour la coloration intracellulaire de Foxp3, les cellules ont été fixées et perméabilisées avec un tampon de fixation/perméabilisation de Foxp3, puis colorées avec un Foxp3-FITC anti-humain ou un contrôle d'isotype (IgG1-FITC) (tous de BioLegend, CA, USA). Pour l'analyse des cytokines intracellulaires, les PBMC stimulées par Der p1 ont été colorées en surface avec des anti-CD3-APC et des anti-CD8-PerCP, et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %/PBS. Après avoir été perméabilisées à l'aide de la solution de perméabilisation FACS (BD Pharmingen, CA, États-Unis), les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante avec anti-IL-4-PE plus anti-IFN-γ-FITC ou anti-IL-10-PE plus anti-IL-4-FITC, et chaque anticorps a été apparié avec un isotype IgG1 respectif comme contrôle (tous de BD Pharmingen). Différents sous-ensembles T ont été sélectionnés pour une analyse phénotypique détaillée comme suit : (1) Cellules Th1 : IFN-γ + IL-4-CD3 + CD8- Cellules T ; (2) Cellules Th2 : IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-cellules T ; et (3) Cellules Tr1 : IL-10+IL-4-CD3+CD8-cellules T. Pour chaque analyse, au moins 20 000 événements ont été collectés. L'analyse a été réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences, NJ, USA).

Les PBMC ELISA ont été remis en suspension à 2 × 106 cellules/mL dans du milieu RPMI-1640 et stimulés avec 10 μg/mL de Der p1 (allergène majeur D. pteronyssinus 1, Indoor Biotechnologies, Royaume-Uni). Les cultures ont été incubées pendant 6 jours à 37 ºC dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. Les surnageants de cultures de PBMC stimulées par des allergènes ont été testés pour la présence d'IFN-γ, d'IL-4 et d'IL-10 au moyen d'ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA).

Isolement des cellules Treg CD4+CD25high Du sang hépariné a été obtenu à partir de chacun des huit enfants recrutés traités par SIT et de huit témoins AR pour l'isolement cellulaire et l'analyse fonctionnelle. Après que les cellules non CD4 + dans les PBMC aient été éliminées par colonne LD avec un cocktail biotine-anticorps et des microbilles d'antibiotine, les cellules T CD4 + ont été isolées des PBMC par sélection négative et les cellules T CD4 + CD25 + ont été sélectionnées positivement à partir des cellules T CD4 +. Enfin, les fractions CD25- ont été récupérées à l'aide d'une colonne MS-magnétique en utilisant un kit d'isolement de lymphocytes T régulateurs CD4 + CD25 + humains conformément aux instructions du fabricant (Miltenyi Biotec, Allemagne). Les cellules avec l'expression de CD25 la plus élevée (CD25high) ont été sélectionnées par incubation avec une quantité limitée de billes d'anticorps anti-CD25 (2 µl de billes anti-CD25/107 cellules) [17]. La pureté moyenne des CD4 + isolés était de 95% (93-97%) et de 76% (72-88%) pour les lymphocytes T CD4 + CD25high positifs pour Foxp3.

Capacité de suppression des cellules CD4+CD25high Treg Pour évaluer la capacité de suppression des cellules CD4+CD25high Treg, la prolifération cellulaire et la cytokine ont été analysées. Les lymphocytes T CD4+CD25- (répondeurs) seuls ou en mélange les lymphocytes T CD4+CD25- et les lymphocytes T CD4+CD25high (suppresseurs) dans un rapport de 2:1 ont été cultivés dans un volume final de 200 µl de milieu RPMI-1640 avec 10 µg /ml Der p1. Les cultures ont été incubées pendant 6 jours à 37 ºC dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Des PBMC irradiés autologues (3000 rad) ont été ajoutés à 2 × 105 en tant que cellules présentatrices d'antigène à des cultures de cellules CD4 + CD25-T. Dans tous les cas, des puits de milieu en triple ont été inclus comme témoins négatifs. Au sixième jour, 100 µl de surnageant ont été prélevés pour l'analyse des cytokines Th1 et Th2 (IFN-γ et IL-4) avec un kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA). La prolifération cellulaire des lymphocytes T CD4 + CD25- a ensuite été évaluée à l'aide d'un kit de prolifération cellulaire WST-8 (sel de tétrazolium modifié) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japon) selon les protocoles des fabricants. Le résultat de prolifération a été exprimé en absorbance à 450 nm du milieu de culture.

Statistiques La signification statistique entre les groupes a été analysée à l'aide d'un test de Mann-Whitney. L'importance des changements intra-groupe avant et après le traitement a été déterminée à l'aide d'un test non paramétrique de paires appariées de Wilcoxon. Le coefficient de corrélation r a été généré à l'aide de la corrélation de Pearson. Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique SPSS version 13.0. Un niveau de signification de 5 % a été utilisé (α = 0,05), puissance (1- β) égale à 90 %. Tous les tests étaient bilatéraux et les valeurs P inférieures à 0,05 étaient considérées comme statistiquement significatives.