CD4+CD25+Foxp3+ 和分泌 IL-10 的 I 型 T 调节细胞对变应性鼻炎儿童的簇特异性免疫治疗的不同反应

患者 该设计是一项为期一年的随机开放标签平行组研究，其中患者以 1:1 的比例随机接受带屋尘螨提取物的 SIT（Alutard SQ，ALK-Abello'，Hørsholm，丹麦）或观察标准药物治疗（对照组）。

研究参与者包括 50 名对屋尘螨 (HDM) 过敏的 9-13 岁儿童，他们接受了含屋尘螨 (Der p) 提取物的 SIT 治疗一年。 将这些与作为对照的 21 名 9-14 岁的 HDM 过敏儿童进行了比较。 所有患儿均为汉族，招募自北京同仁医院过敏门诊。 他们有至少三年的 HDM 诱发的中度或重度鼻结膜炎病史。 每个患者的皮肤点刺试验 (SPT) 也呈阳性 Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Denmark)，风团直径至少为 6 mm，并且 Der p 特异性免疫球蛋白 E (IgE) 呈阳性（ Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)，RAST 值至少为 0.7 kU/L。 有哮喘或特应性皮炎病史的儿童被排除在外。 接受免疫治疗的儿童与特应性供体的年龄、性别、对 Der p 的 SPT 反应、总 IgE 和对 Der p 的特异性 IgE 水平相匹配（表 1）。 该研究方案得到了我们人体研究机构审查委员会的批准，并获得了所有受试者的知情同意。

免疫治疗方案 根据我们之前描述的集群方案，接受皮下免疫治疗的儿童被给予屋尘螨提取物（Alutard SQ，ALK-Abello，Hørsholm，丹麦）[15]。 在最初的六周内，孩子们接受了剂量增加的访问，每周注射两次，间隔一小时，剂量增加。 在第六周给予的最高浓度具有 100,000 SQ/ml 的过敏活性，并含有 9.8 μg/ml Der p1。 第六周后，给药间隔增加到一个月并维持到第一年年底。 对于随机分配到非 SIT 组的患者，持续性鼻炎通过药物疗法（包括鼻内类固醇和口服抗组胺药）得到控制。 在研究期间鼻内类固醇保持相同剂量，并根据需要使用抗组胺药。 两组均在基线和治疗一年后采集血样。

临床评估 AR 儿童的症状通过总 5 项症状评分 (T5SS) 进行评估，包括流鼻涕、打喷嚏、鼻塞以及鼻部和眼部瘙痒。 每个症状都按 0-3 的等级评分（0 = 无，3 = 严重）。 如前所述 [16]，每天对药物使用情况进行评分和记录。 任意分数归因于所使用的药物（1 口鼻用皮质类固醇为 0.75 分，1 片抗组胺药为 1 分）。 患者被指示仅使用局部类固醇（如果症状没有改善则加上抗组胺药）并在日记中报告每次给药或初始药物治疗的变化。 还指示患者在采血前至少 7 天停药。

流式细胞术通过静脉穿刺获得外周血并收集到不含防腐剂的肝素中。 通过 Ficoll-Plaque Plus 密度梯度离心法 (Amersham Biosciences, NJ, USA) 分离外周血单核细胞 (PBMC)。 对于细胞因子的细胞内检测，用 10 μg/mL Der p1（D. pteronyssinus major allergen 1，Indoor Biotechnologies，英国）刺激 PBMC（2 × 106 个细胞/mL）24 小时。 25 ng/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 (PMA)、1 μg/mL 离子霉素和 1.7 μg/mL 莫能菌素在 37 °C 下加入刺激的最后四个小时（均来自美国密苏里州 Sigma） .

对于流式细胞术，PBMC 在室温下用抗 CD4-PerCP 和抗 CD25-PE 或同种型对照（小鼠 IgG1-PerCP 或 IgG1-PE）（均来自 Beckman Coulter, CA, USA）进行表面染色 20 分钟. 对于 Foxp3 的细胞内染色，将细胞固定并用 Foxp3 固定/透化缓冲液透化，然后用抗人 Foxp3-FITC 或同种型对照 (IgG1-FITC)（均来自 BioLegend，CA，USA）染色。 对于细胞内细胞因子分析，Der p1 刺激的 PBMC 用抗 CD3-APC 和抗 CD8-PerCP 进行表面染色，并用 4% 多聚甲醛/PBS 固定。 使用 FACS 透化溶液（BD Pharmingen，CA，USA）透化后，细胞在室温下与抗 IL-4-PE 加抗 IFN-γ-FITC 或抗 IL-10-PE 孵育 30 分钟加上抗​​ IL-4-FITC，并且每种抗体都与相应的同种型 IgG1 相匹配作为对照（均来自 BD Pharmingen）。 选择不同的T亚群进行详细的表型分析如下：（1）Th1细胞：IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-T细胞； (2) Th2细胞：IL-4+IFN-γ-CD3+CD8- T细胞； (3)Tr1细胞：IL-10+IL-4-CD3+CD8-T细胞。 对于每个分析，至少收集了 20,000 个事件。 使用 FACSCalibur 流式细胞仪（BD Biosciences，NJ，USA）进行分析。

ELISA PBMC 以 2 × 106 个细胞/mL 重悬于 RPMI-1640 培养基中，并用 10 μg/mL Der p1（屋尘螨主要过敏原 1，Indoor Biotechnologies，英国）刺激。 培养物在 37 ºC 的含 5% CO2 的加湿培养箱中培养 6 天。 通过 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA) 测定来自过敏原刺激的 PBMC 培养物的上清液中 IFN-γ、IL-4 和 IL-10 的存在。

CD4+CD25high Treg 细胞的分离肝素化血液从八名接受 SIT 治疗的招募儿童和八名 AR 对照中获取，用于细胞分离和功能分析。 PBMCs 中的非 CD4+ 细胞通过 LD 柱与生物素-抗体混合物和抗生素微珠去除后，通过阴性选择从 PBMCs 中分离出 CD4+ T 细胞，并从 CD4+ T 细胞中阳性选择 CD4+ CD25+ T 细胞。 最后，根据制造商的说明（Miltenyi Biotec，德国），使用人 CD4+CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒，使用 MS 磁柱回收 CD25- 级分。 通过与有限量的抗 CD25 抗体珠（2 μl 抗 CD25 珠/107 个细胞）孵育来选择具有最高 CD25 表达 (CD25high) 的细胞[17]。 对于 Foxp3 阳性的 CD4+CD25high T 细胞，分离的 CD4+ 的平均纯度为 95% (93-97%) 和 76% (72-88%)。

CD4+CD25high Treg 细胞的抑制能力为了评价CD4+CD25high Treg 细胞的抑制能力，分析了细胞增殖和细胞因子。 CD4+CD25-T 细胞（应答者）单独或混合 CD4+CD25-T 细胞和 CD4+CD25high T 细胞（抑制细胞）以 2:1 的比例在终体积为 200 µl RPMI-1640 培养基中培养，其中 10 µg /ml Der p1。 培养物在 37 ºC 的 5% CO2 加湿培养箱中培养 6 天。 以 2 × 105 的比例向 CD4+CD25-T 细胞培养物中添加 2 × 105 个自体辐照 PBMC（3000 拉德）作为抗原呈递细胞。 在所有情况下，一式三份的培养基孔作为阴性对照。 在第六天，取出 100 µl 上清液用于 Th1 和 Th2 细胞因子（IFN-γ 和 IL-4）分析，使用 ELISA 试剂盒（R&D Systems，明尼阿波利斯，美国）。 然后根据制造商的方案使用 WST-8（改良的四唑盐）细胞增殖试剂盒（Cell Counting Kit-8，Dojin，Japan）评估 CD4+CD25-T 细胞的细胞增殖。 增殖结果表示为培养基在450nm处的吸光度。

统计学 使用Mann-Whitney检验分析组间的统计学显着性。 使用非参数 Wilcoxon 配对检验确定组内治疗前后变化的显着性。 使用 Pearson 相关系数生成相关系数 r。 所有分析均使用 SPSS 13.0 版统计软件进行。 使用 5% 的显着性水平 (α = 0.05)，功效 (1- β) 等于 90%。 所有测试都是双尾的，小于 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。