Eindeutige Reaktion von CD4+CD25+Foxp3+ und IL-10-sekretierenden Typ-I-T-Regulationszellen auf eine Cluster-spezifische Immuntherapie bei Kindern mit allergischer Rhinitis

Patienten Das Design war eine einjährige, randomisierte Open-Label-Parallelgruppenstudie, in der Patienten im Verhältnis 1:1 randomisiert wurden, um eine SIT mit Dermatophagoides pteronyssinus-Extrakt (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dänemark) zu erhalten oder zu beobachten mit Standard-Pharmakotherapie (Kontrollgruppe).

Zu den Studienteilnehmern gehörten 50 gegen Hausstaubmilben (HDM) allergische Kinder im Alter von 9 bis 13 Jahren, die ein Jahr lang eine SIT mit Dermatophagoides pteronyssinus (Der p)-Extrakt erhielten. Diese wurden mit 21 HDM-allergischen Kindern im Alter von 9-14 Jahren verglichen, die als Kontrollen dienten. Alle Kinder waren Han-Nationalität und wurden aus der Allergieklinik des TongRen-Krankenhauses in Peking rekrutiert. Sie hatten eine Vorgeschichte von HDM-induzierter mittelschwerer oder schwerer Rhinokonjunktivitis von mindestens drei Jahren Dauer. Jeder Patient hatte auch ein positives Haut-Prick-Test (SPT)-Ergebnis für Der p (ALK-Abello', Hørsholm, Dänemark) mit einem Quaddeldurchmesser von mindestens 6 mm und war positiv für spezifisches Immunglobulin E (IgE) gegen Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Schweden), mit einem RAST-Wert von mindestens 0,7 kU/L. Kinder mit Asthma oder atopischer Dermatitis in der Vorgeschichte wurden ausgeschlossen. Die Kinder, die sich einer Immuntherapie unterziehen, wurden hinsichtlich Alter, Geschlecht, SPT-Antwort auf Der p, Gesamt-IgE- und spezifischer IgE-zu-Der-p-Spiegel atopischen Spendern zugeordnet (Tabelle 1). Das Studienprotokoll wurde von unserem institutionellen Prüfungsausschuss für Studien am Menschen genehmigt, und von allen Probanden wurde die Einverständniserklärung eingeholt.

Immuntherapieprotokoll Kinder, die sich einer subkutanen Immuntherapie unterzogen, erhielten Dermatophagoides pteronyssinus-Extrakt (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dänemark) gemäß einem Clusterprotokoll, das wir zuvor beschrieben haben[15]. In den ersten sechs Wochen wurden die Kinder zur Aufdosierung aufgesucht und erhielten zwei Injektionen im Abstand von einer Stunde mit wöchentlich steigender Dosis. Die höchste Konzentration, verabreicht in der sechsten Woche, hatte eine allergene Aktivität von 100.000 SQ/ml und enthielt 9,8 μg/ml Der p1. Nach der sechsten Woche wurde das Dosierungsintervall auf einen Monat verlängert und bis zum Ende des ersten Jahres beibehalten. Bei Patienten, die in die Nicht-SIT-Gruppe randomisiert wurden, wurde die persistierende Rhinitis mit einer Pharmakotherapie einschließlich intranasaler Steroide und oraler Antihistaminika behandelt. Intranasale Steroide wurden während der Studie in derselben Dosis gehalten und Antihistaminika wurden nach Bedarf verwendet. Blutproben wurden bei der Grundlinie und nach einjähriger Behandlung in beiden Gruppen entnommen.

Klinische Bewertung Die Symptome von AR-Kindern wurden anhand des Total 5 Symptom Score (T5SS) bewertet, der Rhinorrhoe, Niesen, verstopfte Nase sowie Nasen- und Augenjucken umfasst. Jedes Symptom wurde auf einer Skala von 0-3 (0 = keine, 3 = schwer) bewertet. Die Medikamenteneinnahme wurde täglich gezählt und aufgezeichnet, wie zuvor beschrieben [16]. Die verwendeten Medikamente wurden willkürlich bewertet (0,75 Punkte für 1 Sprühstoß nasale Kortikosteroide und 1 Punkt für 1 Antihistamintablette). Die Patienten wurden angewiesen, nur lokale Steroide zu verwenden (plus Antihistaminika, wenn sie keine Besserung der Symptome bewirkten) und jede Verabreichung oder Variation der anfänglichen medikamentösen Therapie im Tagebuch anzugeben. Die Patienten wurden außerdem angewiesen, die Medikamente mindestens 7 Tage vor der Blutentnahme abzusetzen.

Durchflusszytometrie Peripheres Blut wurde durch Venenpunktion erhalten und in konservierungsmittelfreiem Heparin gesammelt. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden mittels Ficoll-Plaque Plus-Dichtegradientenzentrifugation (Amersham Biosciences, NJ, USA) isoliert. Für den intrazellulären Nachweis von Zytokinen wurden PBMCs (2 × 106 Zellen/ml) mit 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus Hauptallergen 1, Indoor Biotechnologies, Vereinigtes Königreich) für 24 Stunden stimuliert. Fünfundzwanzig ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), 1 μg/ml Ionomycin und 1,7 μg/ml Monensin wurden bei 37 °C für die letzten vier Stunden der Stimulation hinzugefügt (alle von Sigma, Missouri, USA). .

Für die Durchflusszytometrie wurden PBMCs bei Raumtemperatur 20 Minuten lang mit Anti-CD4-PerCP und Anti-CD25-PE oder Isotypkontrolle (Maus-IgG1-PerCP oder IgG1-PE) oberflächengefärbt (alle von Beckman Coulter, CA, USA). . Für die intrazelluläre Färbung von Foxp3 wurden die Zellen mit Foxp3-Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer fixiert und permeabilisiert, dann mit Anti-Human-Foxp3-FITC oder Isotypkontrolle (IgG1-FITC) (alle von BioLegend, CA, USA) gefärbt. Für die intrazelluläre Zytokinanalyse wurden Der-p1-stimulierte PBMCs mit Anti-CD3-APC und Anti-CD8-PerCP oberflächengefärbt und mit 4 % Paraformaldehyd/PBS fixiert. Nach Permeabilisierung unter Verwendung von FACS Permeabilizing Solution (BD Pharmingen, CA, USA) wurden die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Anti-IL-4-PE plus Anti-IFN-γ-FITC oder Anti-IL-10-PE inkubiert plus Anti-IL-4-FITC, und jeder Antikörper wurde mit einem entsprechenden Isotyp IgG1 als Kontrolle abgeglichen (alle von BD Pharmingen). Verschiedene T-Untergruppen wurden für eine detaillierte phänotypische Analyse wie folgt ausgewählt: (1) Th1-Zellen: IFN-γ+IL-4-CD3+CD8-T-Zellen; (2) Th2-Zellen: IL-4+IFN-γ-CD3+CD8-T-Zellen; und (3) Tr1-Zellen: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-Zellen. Für jede Analyse wurden mindestens 20.000 Ereignisse gesammelt. Die Analyse wurde unter Verwendung eines FACSCalibur-Durchflusszytometers (BD Biosciences, NJ, USA) durchgeführt.

ELISA-PBMCs wurden mit 2 × 106 Zellen/ml in RPMI-1640-Medium resuspendiert und mit 10 μg/ml Der p1 (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Vereinigtes Königreich) stimuliert. Die Kulturen wurden 6 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert. Überstände von Allergen-stimulierten PBMCs-Kulturen wurden mittels ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA) auf das Vorhandensein von IFN-γ, IL-4 und IL-10 untersucht.

Isolierung von CD4+CD25high-Treg-Zellen Heparinisiertes Blut wurde von jedem der acht rekrutierten SIT-behandelten Kinder und acht AR-Kontrollen zur Zellisolierung und Funktionsanalyse erhalten. Nachdem Nicht-CD4+-Zellen in den PBMCs durch eine LD-Säule mit einem Biotin-Antikörper-Cocktail und Antibiotin-Mikroperlen entfernt wurden, wurden CD4+-T-Zellen durch negative Selektion aus den PBMCs isoliert, und CD4+CD25+-T-Zellen wurden positiv aus den CD4+-T-Zellen selektiert. Schließlich wurden CD25-Fraktionen unter Verwendung einer MS-Magnetsäule unter Verwendung eines humanen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zell-Isolationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotec, Deutschland) gewonnen. Zellen mit der höchsten CD25-Expression (CD25high) wurden durch Inkubation mit einer begrenzten Menge an Anti-CD25-Antikörperkügelchen (2 μl Anti-CD25-Kügelchen/107 Zellen) selektiert[17]. Die mittlere Reinheit des isolierten CD4+ betrug 95 % (93–97 %) und 76 % (72–88 %) für CD4+CD25high-T-Zellen, die Foxp3-positiv waren.

Unterdrückungskapazität von CD4+CD25high-Treg-Zellen Zur Bewertung der Unterdrückungskapazität von CD4+CD25high-Treg-Zellen wurden Zellproliferation und Zytokin analysiert. CD4+CD25-T-Zellen (Responder) allein oder gemischte CD4+CD25-T-Zellen und CD4+CD25high-T-Zellen (Suppressoren) in einem Verhältnis von 2:1 wurden in einem Endvolumen von 200 &mgr;l RPMI-1640-Medium mit 10 &mgr;g kultiviert /ml Der p1. Die Kulturen wurden 6 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert. Autologe bestrahlte PBMCs (3000 rad) wurden mit 2 × 105 als Antigen-präsentierende Zellen zu CD4+CD25-T-Zellkulturen gegeben. In allen Fällen wurden Mediumvertiefungen in dreifacher Ausfertigung als Negativkontrollen eingeschlossen. Am sechsten Tag wurden 100 &mgr;l Überstand für die Th1- und Th2-Cytokin-(IFN-γ und IL-4)-Analyse mit einem ELISA-Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA) entfernt. Die Zellproliferation von CD4+CD25-T-Zellen wurde dann unter Verwendung eines WST-8-Zellproliferationskits (modifiziertes Tetrazoliumsalz) (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japan) gemäß den Protokollen des Herstellers bewertet. Das Proliferationsergebnis wurde als Extinktion des Kulturmediums bei 450 nm ausgedrückt.

Statistik Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung eines Mann-Whitney-Tests analysiert. Die Signifikanz der gruppeninternen Veränderungen vor und nach der Therapie wurde mit einem nichtparametrischen Wilcoxon-Matching-Pairs-Test bestimmt. Der Korrelationskoeffizient r wurde unter Verwendung der Pearson-Korrelation generiert. Alle Analysen wurden unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS Version 13.0 durchgeführt. Es wurde ein Signifikanzniveau von 5 % verwendet (α = 0,05), Power (1 – β) gleich 90 %. Alle Tests waren zweiseitig, und P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.