CD4+CD25+Foxp3+- ja IL-10:tä erittävien tyypin I T säätelysolujen selkeä vaste klusterispesifiseen immunoterapiaan allergisessa nuhassa lapsissa

Potilaat Suunnitelma oli vuoden mittainen, satunnaistettu, avoin rinnakkaisryhmätutkimus, jossa potilaat satunnaistettiin suhteessa 1:1 saamaan SIT:tä Dermatophagoides pteronyssinus -uutteella (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Tanska) tai tarkkailemaan. tavallisella farmakoterapialla (kontrolliryhmä).

Tutkimukseen osallistui 50 talon pölypunkille (HDM) allergista 9-13-vuotiasta lasta, jotka saivat SIT:tä Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) -uutteella yhden vuoden ajan. Näitä verrattiin 21 HDM-allergiseen 9–14-vuotiaaseen lapseen, jotka toimivat kontrolleina. Kaikki lapset olivat han-kansalaisia, ja heidät värvättiin Pekingin TongRenin sairaalan allergiaklinikalta. Heillä on ollut HDM:n aiheuttama kohtalainen tai vaikea rinokonjunktiviitti vähintään kolmen vuoden ajan. Jokaisella potilaalla oli myös positiivinen ihopistotesti (SPT) Der p:lle (ALK-Abello', Hørsholm, Tanska), jonka renkaan halkaisija oli vähintään 6 mm, ja ne olivat positiivisia spesifiselle immunoglobuliini E:lle (IgE) Der p:lle ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Ruotsi), jonka RAST-arvo on vähintään 0,7 kU/L. Lapset, joilla on ollut astma tai atooppinen ihottuma, suljettiin pois. Immunoterapiaa saaneet lapset sovitettiin atooppisiin luovuttajiin iän, sukupuolen, SPT-vasteen Der p:lle, kokonais-IgE:n ja spesifisen IgE:n Der p -tasojen suhteen (taulukko 1). Tutkimusprotokollamme hyväksyi instituutiomme ihmistutkimusten arviointilautakunta, ja kaikilta koehenkilöiltä saatiin tietoinen suostumus.

Immunoterapiaprotokolla Ihonalaista immunoterapiaa saaville lapsille annettiin Dermatophagoides pteronyssinus -uutetta (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Tanska) aiemmin kuvailemamme klusteriprotokollan mukaisesti[15]. Ensimmäisen kuuden viikon aikana lapsille tehtiin lisäannostelukäyntejä, ja he saivat kaksi injektiota tunnin välein ja joka viikko nostettiin annosta. Korkeimmalla pitoisuudella, joka annettiin kuudennella viikolla, allergeeninen aktiivisuus oli 100 000 SQ/ml ja se sisälsi 9,8 μg/ml Der p1:tä. Viikon kuudennen jälkeen annosväliä pidennettiin yhteen kuukauteen ja säilytettiin ensimmäisen vuoden loppuun asti. Muihin kuin SIT-ryhmään satunnaistetuilla potilailla jatkuva nuha hoidettiin farmakoterapialla, joka sisälsi intranasaalisia steroideja ja oraalisia antihistamiineja. Nenänsisäisiä steroideja pidettiin samassa annoksessa tutkimuksen aikana ja antihistamiineja käytettiin tarpeen mukaan. Verinäytteet otettiin molemmissa ryhmissä lähtötilanteessa ja vuoden hoidon jälkeen.

Kliininen arviointi AR-lasten oireet arvioitiin Total 5 Symptom Score (T5SS) -pistemäärällä, joka sisältää rinorreaa, aivastelua, nenän tukkoisuutta sekä nenän ja silmän kutinaa. Jokainen oire pisteytettiin asteikolla 0-3 (0 = ei mitään, 3 = vakava). Lääkkeiden käyttö pisteytettiin ja kirjattiin päivittäin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Käytettyjen lääkkeiden ansioksi laskettiin mielivaltaiset pisteet (0,75 pistettä yhdestä nenän kortikosteroidihuuhtelusta ja 1 pisteestä 1 antihistamiinitabletista). Potilaita neuvottiin käyttämään vain paikallisia steroideja (sekä antihistamiineja, jos ne eivät parantaneet oireita) ja raportoimaan päiväkirjaan jokaisesta alkuperäisen lääkehoidon annosta tai vaihtelusta. Potilaita kehotettiin myös lopettamaan huumeiden käyttö vähintään 7 päivää ennen verinäytteenottoa.

Virtaussytometria Perifeerinen veri otettiin laskimopunktiolla ja kerättiin säilöntäainevapaaseen hepariiniin. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) eristettiin Ficoll-Plaque Plus -tiheysgradienttisentrifugoinnilla (Amersham Biosciences, NJ, USA). Sytokiinin solunsisäistä havaitsemista varten PBMC:itä (2 x 106 solua/ml) stimuloitiin 10 μg/ml Der p1:llä (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Yhdistynyt kuningaskunta) 24 tunnin ajan. Kaksikymmentäviisi ng/ml forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA), 1 μg/ml ionomysiiniä ja 1,7 μg/ml monensiinia lisättiin 37 °C:ssa viimeisten neljän tunnin stimulaation ajaksi (kaikki Sigmasta, Missourista, USA:sta). .

Virtaussytometriaa varten PBMC:t pintavärjättiin huoneenlämmössä 20 minuutin ajan anti-CD4-PerCP:llä ja anti-CD25-PE:llä tai isotyyppikontrollilla (hiiren IgG1-PerCP tai IgG1-PE) (kaikki Beckman Coulter, CA, USA) . Foxp3:n solunsisäistä värjäystä varten solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin Foxp3-kiinnitys/permeabilisaatiopuskurilla, sitten värjättiin anti-ihmis-Foxp3-FITC:llä tai isotyyppikontrollilla (IgG1-FITC) (kaikki BioLegendistä, CA, USA). Solunsisäistä sytokiinianalyysiä varten Der p1 -stimuloidut PBMC:t pintavärjättiin anti-CD3-APC:llä ja anti-CD8-PerCP:llä ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä/PBS:llä. Sen jälkeen, kun solut oli permeabilisoitu käyttämällä FACS-läpäisyliuosta (BD Pharmingen, CA, USA), niitä inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa anti-IL-4-PE:n ja anti-IFN-y-FITC:n tai anti-IL-10-PE:n kanssa. plus anti-IL-4-FITC, ja jokainen vasta-aine yhdistettiin vastaavan isotyypin IgG1 kanssa kontrollina (kaikki BD Pharmingenilta). Eri T-alajoukot valittiin yksityiskohtaista fenotyyppianalyysiä varten seuraavasti: (1) Th1-solut: IFN-y+IL-4-CD3+CD8-T-solut; (2) Th2-solut: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-solut; ja (3) Tr1-solut: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-solut. Jokaista analyysiä varten kerättiin vähintään 20 000 tapahtumaa. Analyysi suoritettiin käyttämällä FACSCalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences, NJ, USA).

ELISA PBMC:t suspendoitiin uudelleen tiheyteen 2 x 106 solua/ml RPMI-1640-elatusaineeseen ja stimuloitiin 10 ug/ml Der p1:llä (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Yhdistynyt kuningaskunta). Viljelmiä inkuboitiin 6 päivää 37 ºC:ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5 % CO2:ta. Allergeenistimuloitujen PBMC-viljelmien supernatantit määritettiin IFN-y:n, IL-4:n ja IL-10:n läsnäolon suhteen ELISA:n avulla (R&D Systems, Minneapolis, USA).

CD4+CD25 High Treg -solujen eristäminen Heparinisoitua verta saatiin jokaiselta kahdeksasta rekrytoidusta SIT-käsitellystä lapsesta ja kahdeksasta AR-kontrollista solujen eristämistä ja toiminnallista analyysiä varten. Sen jälkeen, kun PBMC:issä olevat ei-CD4+-solut poistettiin LD-kolonnilla biotiini-vasta-aineseoksella ja antibiotiinimikrohelmillä, CD4+ T-solut eristettiin PBMC:istä negatiivisella valinnalla ja CD4+CD25+ T-solut valikoitiin positiivisesti CD4+ T-soluista. Lopuksi CD25-fraktiot otettiin talteen käyttämällä MS-magneettikolonnia käyttäen ihmisen CD4+CD25+-säätely-T-solueristyspakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti (Miltenyi Biotec, Saksa). Solut, joilla oli korkein CD25-ilmentymä (CD25high), valittiin inkuboimalla rajoitetun määrän anti-CD25-vasta-ainehelmiä (2 μl anti-CD25-helmiä/107 solua) [17]. Eristetyn CD4+:n keskimääräinen puhtaus oli 95 % (93-97 %) ja 76 % (72-88 %) Foxp3-positiivisten CD4+CD25-high-T-solujen osalta.

CD4+CD25high Treg -solujen suppressiokyky CD4+CD25high Treg -solujen suppressiokyvyn arvioimiseksi analysoitiin solujen lisääntyminen ja sytokiini. CD4+CD25-T-solut (vastajat) yksinään tai CD4+CD25-T-soluja ja CD4+CD25-high-T-soluja (suppressoreita) suhteessa 2:1 viljeltiin lopullisessa tilavuudessa 200 µl RPMI-1640-elatusainetta, jossa oli 10 µg. /ml Der p1. Viljelmiä inkuboitiin 6 päivää 37 ºC:ssa kostutetussa inkubaattorissa, jossa oli 5 % CO2:ta. Autologisia säteilytettyjä PBMC:itä (3000 rad) lisättiin 2 x 105 antigeeniä esittelevinä soluina CD4+CD25-T-soluviljelmiin. Kaikissa tapauksissa kolminkertaiset elatusainekuopat sisällytettiin negatiivisiksi kontrolleiksi. Kuudentena päivänä 100 ui supernatanttia poistettiin Th1- ja Th2-sytokiinien (IFN-y ja IL-4) analyysiä varten ELISA-pakkauksella (R&D Systems, Minneapolis, USA). CD4+CD25-T-solujen soluproliferaatio arvioitiin sitten käyttämällä WST-8 (modifioitu tetratsoliumsuola) -soluproliferaatiokittiä (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japani) valmistajien ohjeiden mukaisesti. Proliferaatiotulos ilmaistiin absorbanssina viljelyalustan 450 nm:ssä.

Tilastot Tilastollinen merkitsevyys ryhmien välillä analysoitiin käyttäen Mann-Whitney-testiä. Ryhmänsisäisten ennen ja hoidon jälkeisten muutosten merkitys määritettiin käyttämällä ei-parametrista Wilcoxon matched pairs -testiä. Korrelaatiokerroin r muodostettiin käyttämällä Pearson-korrelaatiota. Kaikki analyysit suoritettiin SPSS version 13.0 tilastoohjelmistolla. Käytettiin 5 %:n merkitsevyystasoa (α = 0,05), teho (1-β) oli 90 %. Kaikki testit olivat kaksisuuntaisia, ja alle 0,05:n P-arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.