A CD4+CD25+Foxp3+ és az IL-10-et kiválasztó I. típusú szabályozó sejtek megkülönböztető válasza a klaszterspecifikus immunterápiára allergiás nátha gyermekekben

Betegek A terv egy egyéves, randomizált, nyílt, párhuzamos csoportos vizsgálat volt, amelyben a betegeket 1:1 arányban randomizálták, hogy Dermatophagoides pteronyssinus kivonattal (Alutard SQ, ALK-Abello', Hørsholm, Dánia) SIT-t kapjanak, vagy megfigyeljék. standard farmakoterápiával (kontrollcsoport).

A vizsgálatban 50 háziporatkára (HDM) allergiás, 9-13 éves gyermek vett részt, akik egy éven keresztül kaptak SIT-t Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) kivonattal. Ezeket 21 HDM-allergiás, 9-14 éves gyermekkel hasonlították össze, akik kontrollként szolgáltak. Valamennyi gyermek Han nemzetiségű volt, és a pekingi TongRen Kórház allergiaklinikájáról vették fel őket. A kórelőzményükben legalább három évig HDM-indukálta közepes vagy súlyos rhino-conjunctivitis szerepelt. Minden páciens pozitív bőrszúrási tesztet (SPT) kapott Der p-re (ALK-Abello', Hørsholm, Dánia), legalább 6 mm-es búzaátmérővel, és pozitív volt a specifikus immunglobulin E (IgE) és Der p ( Pharmacia CAP System, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Svédország), legalább 0,7 kU/L RAST értékkel. A vizsgálatból kizárták azokat a gyermekeket, akiknek kórtörténetében asztma vagy atópiás dermatitis szerepel. Az immunterápiában részesülő gyermekeket az atópiás donorokhoz illesztettük életkor, nem, SPT Der p-re adott válasz, teljes IgE és specifikus IgE-Der p szint alapján (1. táblázat). A vizsgálati protokollt intézményi felülvizsgáló bizottságunk hagyta jóvá humán vizsgálatokhoz, és minden alanytól tájékozott beleegyezést kaptunk.

Immunterápiás protokoll A szubkután immunterápián átesett gyermekek Dermatophagoides pteronyssinus kivonatot (Alutard SQ, ALK-Abello, Hørsholm, Dánia) kaptak egy korábban leírt klaszter protokoll szerint[15]. Az első hat hétben a gyermekeket meglátogatták az adagolás növelésére, két injekciót kaptak egy óra különbséggel, hetente növekvő adaggal. A hatodik héten adott legmagasabb koncentráció 100 000 SQ/ml allergén aktivitást mutatott, és 9,8 μg/ml Der p1-et tartalmazott. A hatodik hét után az adagolási intervallumot egy hónapra növelték, és az első év végéig fenntartották. A nem SIT csoportba randomizált betegeknél a perzisztáló rhinitist farmakoterápiával kezelték, beleértve az intranazális szteroidokat és az orális antihisztaminokat. Az intranazális szteroidokat a vizsgálat során azonos dózisban tartottuk, és szükség szerint antihisztaminokat alkalmaztunk. Vérmintát vettek az alapvonalon és egy éves kezelés után mindkét csoportban.

Klinikai értékelés Az AR gyermekek tüneteit a Total 5 Symptom Score (T5SS) segítségével értékelték, amely magában foglalja az orrfolyást, a tüsszögést, az orrdugulást, valamint az orr- és szemviszketést. Mindegyik tünetet 0-3-ig terjedő skálán értékelték (0 = nincs, 3 = súlyos). A gyógyszerhasználatot naponta pontozták és rögzítették, a korábban leírtak szerint [16]. Önkényes pontszámokat tulajdonítottak az alkalmazott gyógyszereknek (0,75 pont 1 orrkortikoszteroid befújás és 1 pont 1 tabletta antihisztamin). A betegeket arra utasították, hogy csak helyi szteroidokat használjanak (plusz antihisztaminokat, ha azok nem javítanak a tüneteken), és a kezdeti gyógyszeres kezelés minden egyes alkalmazását vagy változását jelentsék a naplóban. A betegeket arra is utasították, hogy a vérvétel előtt legalább 7 nappal hagyják abba a gyógyszer szedését.

Áramlási citometria A perifériás vért vénás punkcióval vettük, és tartósítószer-mentes heparinba gyűjtöttük. Perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltunk Ficoll-Plaque Plus sűrűséggradiens centrifugálással (Amersham Biosciences, NJ, USA). A citokin intracelluláris kimutatására a PBMC-ket (2 × 106 sejt/ml) 10 μg/ml Der p1-gyel (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Egyesült Királyság) stimuláltuk 24 órán keresztül. Huszonöt ng/ml forbol-12-mirisztát-13-acetátot (PMA), 1 μg/ml ionomicint és 1,7 μg/ml monenzint adtunk hozzá 37 °C-on a stimuláció utolsó négy órájában (mindegyik Sigma, Missouri, USA) .

Áramlási citometriához a PBMC-ket szobahőmérsékleten 20 percig festettük anti-CD4-PerCP-vel és anti-CD25-PE-vel, vagy izotípus kontrollal (egér IgG1-PerCP vagy IgG1-PE) (mind a Beckman Coulter, CA, USA) segítségével. . A Foxp3 intracelluláris festéséhez a sejteket fixáltuk és permeabilizáltuk Foxp3 fixáló/permeabilizáló pufferrel, majd anti-humán Foxp3-FITC-vel vagy izotípus kontrollal (IgG1-FITC) festettük (mind a BioLegend, CA, USA). Az intracelluláris citokinanalízishez a Der p1-stimulált PBMC-ket anti-CD3-APC-vel és anti-CD8-PerCP-vel megfestettük, és 4%-os paraformaldehid/PBS-sel fixáltuk. A FACS permeabilizáló oldattal (BD Pharmingen, CA, USA) végzett permeabilizálás után a sejteket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk anti-IL-4-PE plusz anti-IFN-y-FITC vagy anti-IL-10-PE. plusz anti-IL-4-FITC, és mindegyik antitestet a megfelelő IgG1 izotípussal illesztjük kontrollként (mind a BD Pharmingen cégtől). Különböző T alcsoportokat választottunk ki a részletes fenotípusos elemzéshez az alábbiak szerint: (1) Th1-sejtek: IFN-y+IL-4-CD3+CD8-T-sejtek; (2) Th2-sejtek: IL-4+IFN-y-CD3+CD8-T-sejtek; és (3) Tr1-sejtek: IL-10+IL-4-CD3+CD8-T-sejtek. Minden elemzéshez legalább 20 000 eseményt gyűjtöttek össze. Az analízist FACSCalibur áramlási citométerrel (BD Biosciences, NJ, USA) végeztük.

Az ELISA PBMC-ket 2 × 106 sejt/ml koncentrációban RPMI-1640 tápközegben szuszpendáltuk, és 10 μg/ml Der p1-gyel (D. pteronyssinus major allergen 1, Indoor Biotechnologies, Egyesült Királyság) stimuláltuk. A tenyészeteket 6 napon át 37 ºC-on, 5% CO2-t tartalmazó, párásított inkubátorban inkubáltuk. Az allergénnel stimulált PBMC-tenyészetek felülúszóit ELISA-val (R&D Systems, Minneapolis, USA) vizsgáltuk IFN-y, IL-4 és IL-10 jelenlétére.

CD4+CD25 magas Treg-sejtek izolálása Heparinizált vért nyertünk mind a nyolc SIT-kezelt gyermektől és nyolc AR-kontrolltól a sejtizoláláshoz és a funkcionális elemzéshez. Miután a PBMC-kben lévő nem CD4+ sejteket LD oszlopon biotin-antitest koktéllal és antibiotin mikrogyöngyökkel eltávolítottuk, a CD4+ T sejteket negatív szelekcióval izoláltuk a PBMC-kből, és a CD4+ CD25+ T sejteket pozitívan szelektáltuk a CD4+ T sejtek közül. Végül a CD25-frakciókat MS-mágneses oszlop segítségével nyertük ki humán CD4+CD25+ szabályozó T-sejt-izolációs kittel a gyártó utasításai szerint (Miltenyi Biotec, Németország). A legmagasabb CD25-expressziójú (CD25high) sejteket korlátozott mennyiségű anti-CD25 antitest gyöngyökkel (2 μl anti-CD25 gyöngy/107 sejt) végzett inkubációval választottuk ki[17]. Az izolált CD4+ átlagos tisztasága 95% (93-97%) és 76% (72-88%) volt a Foxp3-pozitív CD4+CD25high T-sejtek esetében.

CD4+CD25high Treg sejtek szuppresszív kapacitása A CD4+CD25high Treg sejtek szuppresszív kapacitásának értékelésére sejtproliferációt és citokineket elemeztünk. A CD4+CD25-T-sejteket (válaszadók) önmagukban vagy kevert CD4+CD25-T-sejteket és CD4+CD25-high T-sejteket (szuppresszorok) 2:1 arányban tenyésztettünk 200 µl végső térfogatban 10 µg RPMI-1640 tápközegben. /ml Der p1. A tenyészeteket 6 napig inkubáltuk 37 ºC-on párásított, 5% CO2-t tartalmazó inkubátorban. Autológ besugárzott PBMC-ket (3000 rad) adtunk 2 × 105-ben antigénprezentáló sejtként CD4+CD25-T sejttenyészetekhez. Negatív kontrollként minden esetben három párhuzamos tápközeg-lyukakat vettünk fel. A hatodik napon 100 µl felülúszót távolítottunk el Th1 és Th2 citokin (IFN-y és IL-4) elemzéshez ELISA kittel (R&D Systems, Minneapolis, USA). A CD4+CD25-T-sejtek sejtszaporodását ezután WST-8 (módosított tetrazólium-só) sejtproliferációs kittel (Cell Counting Kit-8, Dojin, Japán) értékeltük a gyártói protokollok szerint. A proliferációs eredményt a táptalaj 450 nm-én mért abszorbanciaként fejeztük ki.

Statisztika A csoportok közötti statisztikai szignifikanciát Mann-Whitney teszttel elemeztük. A csoporton belüli terápia előtti és utáni változások jelentőségét nem paraméteres Wilcoxon párosított teszttel határoztuk meg. Az r korrelációs együtthatót a Pearson-korreláció segítségével állítottuk elő. Minden elemzést az SPSS 13.0 statisztikai szoftverrel végeztünk. 5%-os szignifikanciaszintet alkalmaztunk (α = 0,05), a teljesítmény (1-β) 90%-nak felel meg. Minden teszt kétoldalas volt, és a 0,05-nél kisebb P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.