Genová exprese regulovaná NFAT po takrolimu

Studie bude provedena jako prospektivní, longitudinální studie. Studie je jednocentrová studie prováděná na Lékařské univerzitě ve Štýrském Hradci, Chirurgické klinice, Divize transplantační chirurgie a Klinice sérologie krevních skupin a transfuzního lékařství Lékařské univerzity v Grazu.

Všichni pacienti na seznamu čekatelů LT na oddělení transplantační chirurgie Lékařské univerzity ve Štýrském Hradci jsou vyšetřováni podle kritérií pro zařazení i vyloučení. Doba studia je 1 rok. Jedno základní měření NFAT-RGE se provádí přímo před LT; Měření NFAT-RGE po LT se provádějí v jasně definovaných časových bodech.

Studijní populace. Tato studie jako pilotní studie zahrnuje 15 pacientů, kteří podstoupí LT

Cíle:

• Testovat hypotézu, že u pacientů de-novo TAC užívajících mykofenolát mofetil (MMF) a steroidy po LT existuje inverzní korelace maximálních hladin NFAT-RGE a TAC za 1,5 hodiny po podání TAC
• Korelovat hladiny NFAT-RGE a TAC (minimální a maximální) s epizodami odmítnutí a vedlejšími účinky TAC

Přístup:

NFAT-RGE se stanovuje u 15 pacientů těsně před LT a po LT po 1 dni, 1 týdnu, 2 týdnech a po 1, 6 a 12 měsících.

Metody. Heparinizovaná periferní krev se stimuluje 1 ml kompletního média Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 obsahujícího 100 ng/ml forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA) a 5 mcg/ml ionomycinu (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis , MO, USA) po dobu 3 hodin při 37 °C. Po ex vivo imunitní aktivaci, po lýze červených krvinek pufrem ACK (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), jsou leukocyty lyžovány 400 mcl lyzačního pufru MagNA-Pure doplněného o další 1 % (W/V) dithiothritolu (RAS , Mannheim, Německo) a vzorek se zmrazí na -70 °C. Po rozmrazení se mRNA izoluje pomocí zařízení RNA Blood mini Kit (Quiagen) pomocí standardního protokolu mRNA pro buňky. RNA je reverzně transkribována pomocí systému SuperScript III First-Strand Synthesis System pro RT-PCR (Invitrogen, life technologies). 3 geny regulované NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) byly identifikovány jako vhodné geny pro tento esej z předchozích studií [18, 26]. Cílové mRNA sekvence IFN-y, IL-2, GM-CSF a 3 referenčních genů jsou amplifikovány pomocí komerčně dostupných PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) digitální PCR (Biorad).

RGE po příjmu TAC se vypočítá jako cpeak/c0x100, kde c0 je upravený počet transkriptů na úrovni TAC před podáním dávky a cpeak je počet transkriptů 1,5 (c1,5) hodin po příjmu léku.