Espressione genica regolata da NFAT dopo Tacrolimus

Lo studio sarà condotto come uno studio prospettico longitudinale. Lo studio è uno studio monocentrico eseguito presso l'Università di Medicina di Graz, Dipartimento di Chirurgia, Divisione di Chirurgia dei Trapianti e Dipartimento di Sierologia dei Gruppi Sanguigni e Medicina Trasfusionale, Università di Medicina di Graz.

Tutti i pazienti nella lista d'attesa LT presso la Divisione di Chirurgia dei Trapianti, Università di Medicina di Graz sono sottoposti a screening in base ai criteri di inclusione ed esclusione. Il periodo di studio è di 1 anno. Una misurazione della linea di base NFAT-RGE viene eseguita direttamente prima di LT; Le misurazioni NFAT-RGE dopo LT vengono eseguite in punti temporali chiaramente definiti.

Popolazione di studio. Come sperimentazione pilota, questo studio comprende 15 pazienti che saranno sottoposti a LT

Obiettivi:

• Per testare l'ipotesi che nei pazienti con TAC de-novo che ricevono micofenolato mofetile (MMF) e steroidi dopo LT vi sia una correlazione inversa dei livelli di picco di NFAT-RGE e TAC a 1,5 ore dopo l'assunzione di TAC
• Correlare i livelli di NFAT-RGE e TAC (valle e picco) con gli episodi di rigetto e gli effetti collaterali del TAC

Approccio:

NFAT-RGE è determinato in 15 pazienti appena prima del LT e dopo il LT dopo 1 giorno, 1 settimana, 2 settimane e dopo 1, 6 e 12 mesi.

Metodi. Il sangue periferico eparinizzato viene stimolato con 1 ml di mezzo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 completo contenente 100 ng/ml di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e 5 mcg/ml di ionomicina (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) per 3 ore a 37°C. Dopo l'attivazione immunitaria ex vivo, dopo la lisi dei globuli rossi con tampone ACK (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), i leucociti vengono lisati con 400 mcl di tampone di lisi MagNA-Pure integrato con un ulteriore 1% (P/v) di ditiotritolo (RAS , Mannheim, Germania) e il campione viene congelato a -70°C. Dopo lo scongelamento, l'mRNA viene isolato con il dispositivo RNA Blood mini Kit (Quiagen) utilizzando il protocollo standard dell'mRNA per le cellule. L'RNA viene retrotrascritto utilizzando il sistema di sintesi del primo filamento SuperScript III per RT-PCR (Invitrogen, tecnologie della vita). I 3 geni regolati da NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) sono stati identificati come geni adatti per questo saggio da studi precedenti [18, 26]. Le sequenze target di mRNA di IFN-γ, IL-2, GM-CSF e 3 geni di riferimento vengono amplificate utilizzando PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) disponibili in commercio mediante PCR digitale (Biorad).

L'RGE dopo l'assunzione di TAC è calcolato come cpeak/c0x100, dove c0 è il numero aggiustato di trascritti al livello pre-dose di TAC e cpeak è il numero di trascritti 1,5 (c1,5) ore dopo l'assunzione del farmaco.