NFAT-регулируемая экспрессия генов после такролимуса

Испытание будет проводиться как проспективное лонгитюдное исследование. Исследование представляет собой одноцентровое исследование, проведенное в Медицинском университете Граца, на отделении хирургии, отделении трансплантационной хирургии и отделении серологии групп крови и трансфузионной медицины Медицинского университета Граца.

Все пациенты из списка ожидания ТП в отделении трансплантационной хирургии Медицинского университета Граца проходят скрининг в соответствии как с критериями включения, так и с критериями исключения. Срок обучения 1 год. Одно базовое измерение NFAT-RGE выполняется непосредственно перед LT; Измерения NFAT-RGE после ТП выполняются в четко определенные моменты времени.

Изучение населения. В качестве пилотного исследования это исследование включает 15 пациентов, которым будет проведена ТП.

Цели:

• Проверить гипотезу о том, что у пациентов с ТАС de novo, получающих микофенолата мофетил (ММФ) и стероиды после ТП, существует обратная корреляция пиковых уровней NFAT-RGE и ТАС через 1,5 часа после приема ТАС.
• Сопоставить уровни NFAT-RGE и TAC (минимум и пик) с эпизодами отторжения и побочными эффектами TAC.

Подход:

NFAT-RGE определяют у 15 больных непосредственно перед ТП, а также после ТП через 1 сут, 1 нед, 2 нед, а также через 1, 6 и 12 мес.

Методы. Гепаринизированную периферическую кровь стимулируют 1 мл полной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 100 нг/мл форбол-12-миристата-13-ацетата (PMA) и 5 ​​мкг/мл иономицина (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис). , Миссури, США) в течение 3 часов при 37°C. После активации иммунитета ex vivo, после лизиса эритроцитов буфером ACK (0,15 М NH4CL, 1,0 мМ KHCO3), лейкоциты лизируют 400 мкл буфера для лизиса MagNA-Pure, дополненного дополнительным 1% (масса/объем) дитиотритолом (RAS). , Мангейм, Германия), и образец замораживают при -70°С. После оттаивания мРНК выделяют с помощью устройства RNA Blood mini Kit (Quiagen) с использованием стандартного протокола мРНК для клеток. РНК подвергают обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой нити SuperScript III для ОТ-ПЦР (Invitrogen, life Technologies). 3 NFAT-регулируемых гена (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) были идентифицированы как подходящие гены для этого эссе из предыдущих исследований [18, 26]. Последовательности мРНК-мишеней IFN-γ, IL-2, GM-CSF и 3 эталонных генов амплифицировали с использованием коммерчески доступных анализов PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) с помощью цифровой ПЦР (Biorad).

RGE после приема TAC рассчитывается как cpeak/c0x100, где c0 — скорректированное количество транскриптов на уровне TAC перед приемом, а cpeak — количество транскриптов через 1,5 (c1,5) часа после приема препарата.