Expression génique régulée par NFAT après tacrolimus

L'essai sera mené sous la forme d'une étude longitudinale prospective. L'étude est une étude monocentrique réalisée à l'Université médicale de Graz, Département de chirurgie, Division de chirurgie de transplantation et Département de sérologie des groupes sanguins et de médecine transfusionnelle, Université médicale de Graz.

Tous les patients inscrits sur la liste d'attente LT de la Division de chirurgie de transplantation de l'Université de médecine de Graz sont sélectionnés selon des critères d'inclusion et d'exclusion. La durée des études est de 1 an. Une mesure de ligne de base NFAT-RGE est effectuée directement avant LT ; Les mesures NFAT-RGE après LT sont effectuées à des moments clairement définis.

Population étudiée. En tant qu'essai pilote, cette étude comprend 15 patients qui subiront une LT

Objectifs:

• Tester l'hypothèse selon laquelle chez les patients TAC de novo recevant du mycophénolate mofétil (MMF) et des stéroïdes après LT, il existe une corrélation inverse des niveaux de pointe de NFAT-RGE et de TAC 1,5 heure après la prise de TAC
• Pour corréler les niveaux de NFAT-RGE et de TAC (creux et pic) avec les épisodes de rejet et les effets secondaires du TAC

Approche:

NFAT-RGE est déterminé chez 15 patients juste avant LT, et après LT après 1 jour, 1 semaine, 2 semaines et après 1, 6 et 12 mois.

Méthodes. Le sang périphérique hépariné est stimulé avec 1 ml de milieu complet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 100 ng/ml de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 5 mcg/ml d'ionomycine (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) pendant 3 heures à 37°C. Après activation immunitaire ex vivo, après lyse des globules rouges avec un tampon ACK (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), les leucocytes sont lysés avec 400 mcl de tampon de lyse MagNA-Pure additionné de 1 % (P/v) supplémentaire de dithiothritol (RAS , Mannheim, Allemagne), et l'échantillon est congelé à -70°C. Après décongélation, l'ARNm est isolé avec le dispositif RNA Blood mini Kit (Quiagen) en utilisant le protocole standard d'ARNm pour les cellules. L'ARN est rétrotranscrit à l'aide du système de synthèse du premier brin SuperScript III pour RT-PCR (Invitrogen, technologies de la vie). Les 3 gènes régulés par NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) ont été identifiés comme des gènes appropriés pour cet essai à partir d'études antérieures [18, 26]. Les séquences d'ARNm cibles de l'IFN-γ, de l'IL-2, du GM-CSF et de 3 gènes de référence sont amplifiées à l'aide des tests PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) par PCR numérique (Biorad).

Le RGE après la prise de TAC est calculé comme cpeak/c0x100, où c0 est le nombre ajusté de transcriptions au niveau de prédose de TAC et cpeak est le nombre de transcriptions 1,5 (c1,5) heures après la prise de médicament.