NFAT-gereguleerde genexpressie na Tacrolimus

De proef zal worden uitgevoerd als een prospectieve, longitudinale studie. De studie is een single-center studie uitgevoerd aan de Medische Universiteit van Graz, Afdeling Chirurgie, Afdeling Transplantatiechirurgie en de Afdeling Bloedgroepserologie en Transfusiegeneeskunde, Medische Universiteit van Graz.

Alle patiënten op de LT-wachtlijst van de afdeling Transplantatiechirurgie van de Medische Universiteit van Graz worden gescreend op zowel inclusie- als exclusiecriteria. De studieperiode is 1 jaar. Direct voor LT wordt één NFAT-RGE-nulmeting uitgevoerd; NFAT-RGE-metingen na LT worden uitgevoerd op duidelijk gedefinieerde tijdstippen.

Studie bevolking. Als pilootstudie omvat deze studie 15 patiënten die LT zullen ondergaan

Doelstellingen:

• Om de hypothese te testen dat bij de-novo TAC-patiënten die mycofenolaatmofetil (MMF) en steroïden krijgen na LT, er een omgekeerde correlatie is tussen NFAT-RGE en TAC-piekniveaus 1,5 uur na TAC-inname
• Om zowel NFAT-RGE- als TAC-niveaus (dal en piek) te correleren met afstotingsepisoden en TAC-bijwerkingen

Benadering:

NFAT-RGE wordt bepaald bij 15 patiënten vlak voor LT, en na LT na 1 dag, 1 week, 2 weken en na 1, 6 en 12 maanden.

methoden. Gehepariniseerd perifeer bloed wordt gestimuleerd met 1 ml compleet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium met 100 ng/ml forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) en 5 mcg/ml ionomycine (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, VS) gedurende 3 uur bij 37°C. Na ex vivo immuunactivatie, na lysis van rode bloedcellen met ACK-buffer (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), worden leukocyten gelyseerd met 400 μcl MagNA-Pure lysisbuffer aangevuld met nog eens 1% (W/v) dithiothritol (RAS , Mannheim, Duitsland), en het monster wordt ingevroren bij -70°C. Na ontdooien wordt mRNA geïsoleerd met het RNA Blood mini Kit (Quiagen)-apparaat met behulp van het mRNA-standaardprotocol voor cellen. RNA wordt omgekeerd getranscribeerd met behulp van SuperScript III First-Strand Synthesis System voor RT-PCR (Invitrogen, life technologies). De 3 NFAT-gereguleerde genen (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) werden geïdentificeerd als geschikte genen voor dit essay uit eerdere studies [18, 26]. Doel-mRNA-sequenties van IFN-y-, IL-2-, GM-CSF- en 3 referentiegenen worden geamplificeerd met behulp van in de handel verkrijgbare PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) door digitale PCR (Biorad).

De RGE na TAC-inname wordt berekend als cpeak/c0x100, waarbij c0 het aangepaste aantal transcripten op het TAC-predosisniveau is en cpeak het aantal transcripten 1,5 (c1,5) uur na inname van het geneesmiddel is.