NFAT-reglerat genuttryck efter takrolimus

Försöket kommer att genomföras som en prospektiv, longitudinell studie. Studien är en encenterstudie utförd vid Medical University of Graz, Department of Surgery, Division of Transplant Surgery och Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz.

Alla patienter på LT:s väntelista vid Division of Transplant Surgery, Medical University of Graz screenas enligt både inklusions- och exkluderingskriterier. Studietiden är 1 år. En NFAT-RGE baslinjemätning utförs direkt före LT; NFAT-RGE-mätningar efter LT utförs vid tydligt definierade tidpunkter.

Studera befolkning. Som ett pilotförsök omfattar denna studie 15 patienter som kommer att genomgå LT

Mål:

• För att testa hypotesen att det hos de-novo TAC-patienter som får mykofenolatmofetil (MMF) och steroider efter LT finns en omvänd korrelation mellan NFAT-RGE och TAC-toppnivåer 1,5 timmar efter TAC-intag
• Att korrelera både NFAT-RGE och TAC (dal och topp) nivåer med avstötningsepisoder och TAC biverkningar

Närma sig:

NFAT-RGE bestäms hos 15 patienter strax före LT och efter LT efter 1 dag, 1 vecka, 2 veckor och efter 1, 6 och 12 månader.

Metoder. Hepariniserat perifert blod stimuleras med 1 ml komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 100 ng/ml forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och 5 mcg/ml jonomycin (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) i 3 timmar vid 37°C. Efter ex vivo immunaktivering, efter lysering av röda blodkroppar med ACK-buffert (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), lyseras leukocyter med 400 mcl MagNA-Pure lysbuffert kompletterad med ytterligare 1 % (vikt/volym) ditiotritol (RAS) Mannheim, Tyskland), och provet fryses vid -70°C. Efter upptining isoleras mRNA med enheten RNA Blood mini Kit (Quiagen) med hjälp av mRNA-standardprotokollet för celler. RNA transkriberas omvänt med SuperScript III First-Strand Synthesis System för RT-PCR (Invitrogen, life-teknologier). De 3 NFAT-reglerade generna (IFN-y, IL-2, GM-CSF) identifierades som lämpliga gener för denna uppsats från tidigare studier [18, 26]. Mål-mRNA-sekvenser av IFN-y, IL-2, GM-CSF och 3 referensgener amplifieras med användning av kommersiellt tillgängliga PrimePCR ddPCR genuttrycksprobanalyser (Biorad) med digital PCR (Biorad).

RGE efter TAC-intag beräknas som cpeak/c0x100, där c0 är det justerade antalet transkript vid TAC-fördosnivån och topp är antalet transkript 1,5 (c1,5) timmar efter läkemedelsintag.