Expresión génica regulada por NFAT después de tacrolimus

El ensayo se llevará a cabo como un estudio longitudinal prospectivo. El estudio es un estudio de centro único realizado en la Universidad Médica de Graz, Departamento de Cirugía, División de Cirugía de Trasplante y el Departamento de Serología del Grupo Sanguíneo y Medicina Transfusional, Universidad Médica de Graz.

Todos los pacientes en la lista de espera de LT en la División de Cirugía de Trasplante de la Universidad Médica de Graz se examinan de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión. El período de estudio es de 1 año. Se realiza una medición de referencia de NFAT-RGE directamente antes de LT; Las mediciones de NFAT-RGE después de LT se realizan en puntos de tiempo claramente definidos.

Población de estudio. Como ensayo piloto, este estudio consta de 15 pacientes que se someterán a TH

Objetivos:

• Probar la hipótesis de que en pacientes con TAC de novo que reciben micofenolato mofetilo (MMF) y esteroides después de TH existe una correlación inversa de los niveles máximos de NFAT-RGE y TAC 1,5 horas después de la ingesta de TAC
• Para correlacionar los niveles de NFAT-RGE y TAC (mínimo y pico) con episodios de rechazo y efectos secundarios de TAC

Acercarse:

NFAT-RGE se determina en 15 pacientes justo antes del TH y después del TH después de 1 día, 1 semana, 2 semanas y después de 1, 6 y 12 meses.

Métodos. La sangre periférica heparinizada se estimula con 1 ml de medio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene 100 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 5 mcg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis , MO, EE. UU.) durante 3 horas a 37 °C. Después de la activación inmunitaria ex vivo, después de la lisis de glóbulos rojos con tampón ACK (NH4CL 0,15 M, KHCO3 1,0 mM), los leucocitos se lisan con 400 mcl de tampón de lisis MagNA-Pure complementado con un 1 % (p/v) adicional de ditiotritol (RAS , Mannheim, Alemania), y la muestra se congela a -70°C. Después de la descongelación, el ARNm se aísla con el dispositivo RNA Blood mini Kit (Quiagen) utilizando el protocolo estándar de ARNm para células. El ARN se transcribe de forma inversa utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III para RT-PCR (Invitrogen, tecnologías de la vida). Los 3 genes regulados por NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) se identificaron como genes adecuados para este ensayo a partir de estudios previos [18, 26]. Las secuencias de ARNm diana de IFN-γ, IL-2, GM-CSF y 3 genes de referencia se amplifican utilizando ensayos de sonda de expresión génica PrimePCR ddPCR disponibles comercialmente (Biorad) mediante PCR digital (Biorad).

El RGE después de la ingesta de TAC se calcula como cpeak/c0x100, donde c0 es el número ajustado de transcripciones en el nivel previo a la dosis de TAC y cpeak es el número de transcripciones 1,5 (c1,5) horas después de la ingesta del fármaco.