NFAT által szabályozott génexpresszió a takrolimusz után

A vizsgálatot prospektív, longitudinális vizsgálatként fogják lefolytatni. A tanulmány egy egyközpontú vizsgálat, amelyet a Grazi Orvostudományi Egyetem Sebészeti Osztályán, Transzplantációs Sebészeti Osztályán és a Grazi Orvosi Egyetem Vércsoport-szerológiai és Transzfúziós Orvostudományi Tanszékén végeztek.

A Grazi Orvostudományi Egyetem Transzplantációs Sebészeti Osztályának LT várólistáján szereplő összes beteget mind a felvételi, mind a kizárási kritériumok szerint szűrik. A tanulmányi idő 1 év. Egy NFAT-RGE alapvonal mérést végeznek közvetlenül az LT előtt; Az LT utáni NFAT-RGE-méréseket egyértelműen meghatározott időpontokban végezzük.

Vizsgálati populáció. Kísérleti vizsgálatként ez a tanulmány 15 beteget von maga után, akiket LT-n kell átesni

Célok:

• Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy az LT után mikofenolát-mofetilt (MMF) és szteroidot kapó de-novo TAC betegekben fordított korreláció áll fenn az NFAT-RGE és a TAC csúcsértékei között 1,5 órával a TAC bevétele után.
• Mind az NFAT-RGE, mind a TAC (mélypont és csúcs) szint összefüggésbe hozása a kilökődési epizódokkal és a TAC mellékhatásokkal

Megközelítés:

Az NFAT-RGE-t 15 betegnél határozták meg közvetlenül az LT előtt, majd az LT után 1 nap, 1 hét, 2 hét, valamint 1, 6 és 12 hónap elteltével.

Mód. A heparinizált perifériás vért 1 ml komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 táptalajjal stimuláljuk, amely 100 ng/ml forbol-12-mirisztát-13-acetátot (PMA) és 5 mcg/ml ionomicint (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis) tartalmaz. , MO, USA) 3 órán át 37 °C-on. Ex vivo immunaktiválást követően, ACK pufferrel (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3) végzett vörösvértest-lízist követően a leukocitákat 400 mcl MagNA-Pure lízispufferrel lizálják, amelyet további 1% (w/v) ditiotritollal (RAS) egészítettünk ki. Mannheim, Németország), és a mintát -70 °C-ra fagyasztjuk. Felolvasztás után az mRNS-t izoláljuk az RNA Blood mini Kit (Quiagen) eszközzel, a sejtek mRNS standard protokollját használva. Az RNS reverz átírása SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, life technology) segítségével történik. A 3 NFAT-szabályozott gént (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) korábbi tanulmányok alapján azonosították megfelelő génként ehhez a tanulmányhoz [18, 26]. Az IFN-γ, IL-2, GM-CSF és 3 referenciagén cél-mRNS-szekvenciáját a kereskedelemben kapható PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) segítségével digitális PCR-rel (Biorad) amplifikáljuk.

A TAC-bevitel utáni RGE-t cpeak/c0x100-ként számítjuk ki, ahol c0 a transzkriptumok korrigált száma a dózis előtti TAC-szinten, a cpeak pedig az átiratok száma 1,5 (c1,5) órával a gyógyszer bevétele után.