Expressão Gênica Regulada por NFAT Após Tacrolimus

O julgamento será conduzido como um estudo prospectivo, longitudinal. O estudo é um estudo de centro único realizado na Universidade Médica de Graz, Departamento de Cirurgia, Divisão de Cirurgia de Transplante e Departamento de Serologia de Grupos Sanguíneos e Medicina de Transfusão, Universidade Médica de Graz.

Todos os pacientes na lista de espera de LT na Divisão de Cirurgia de Transplante da Medical University of Graz são triados de acordo com os critérios de inclusão e exclusão. O período de estudo é de 1 ano. Uma medição de linha de base NFAT-RGE é realizada diretamente antes do LT; As medições NFAT-RGE após LT são realizadas em pontos de tempo claramente definidos.

População do estudo. Como um ensaio piloto, este estudo compreende 15 pacientes que serão submetidos a LT

Objetivos.

• Testar a hipótese de que em pacientes com TAC de novo recebendo micofenolato de mofetil (MMF) e esteróides após TH, há uma correlação inversa dos níveis de pico de NFAT-RGE e TAC 1,5 horas após a ingestão de TAC
• Correlacionar os níveis de NFAT-RGE e TAC (vale e pico) com episódios de rejeição e efeitos colaterais do TAC

Abordagem:

O NFAT-RGE é determinado em 15 pacientes imediatamente antes do TH e após o LT após 1 dia, 1 semana, 2 semanas e após 1, 6 e 12 meses.

Métodos. O sangue periférico heparinizado é estimulado com 1 ml de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 completo contendo 100 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e 5 mcg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, EUA) por 3 horas a 37°C. Após a ativação imune ex vivo, após a lise dos glóbulos vermelhos com tampão ACK (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), os leucócitos são lisados ​​com 400 mcl de tampão de lise MagNA-Pure suplementado com 1% adicional (W/v) de ditiotritol (RAS , Mannheim, Alemanha), e a amostra é congelada a -70°C. Após o descongelamento, o mRNA é isolado com o dispositivo RNA Blood mini Kit (Quiagen) usando o protocolo padrão de mRNA para células. O RNA é transcrito reversa usando o Sistema de Síntese de Primeira Cadeia SuperScript III para RT-PCR (Invitrogen, tecnologias de vida). Os 3 genes regulados por NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) foram identificados como genes adequados para este ensaio a partir de estudos anteriores [18, 26]. As sequências de mRNA alvo de IFN-γ, IL-2, GM-CSF e 3 genes de referência são amplificadas usando ensaios de sonda de expressão gênica PrimePCR ddPCR comercialmente disponíveis (Biorad) por PCR digital (Biorad).

O RGE após a ingestão de TAC é calculado como cpeak/c0x100, onde c0 é o número ajustado de transcritos no nível pré-dose de TAC e cpeak é o número de transcritos 1,5 (c1,5) horas após a ingestão do medicamento.