Ekspresja genów regulowana przez NFAT po takrolimusie

Badanie zostanie przeprowadzone jako prospektywne badanie podłużne. Badanie jest jednoośrodkowym badaniem przeprowadzonym na Uniwersytecie Medycznym w Grazu, Klinice Chirurgii, Oddziale Chirurgii Transplantacyjnej oraz Klinice Serologii Grup Krwi i Transfuzjologii Uniwersytetu Medycznego w Grazu.

Wszyscy pacjenci z listy oczekujących LT w Oddziale Chirurgii Transplantacyjnej Uniwersytetu Medycznego w Grazu są badani zarówno pod kątem kryteriów włączenia, jak i wykluczenia. Okres nauki wynosi 1 rok. Jeden pomiar linii podstawowej NFAT-RGE jest wykonywany bezpośrednio przed LT; Pomiary NFAT-RGE po LT są wykonywane w jasno określonych punktach czasowych.

Badana populacja. Jako badanie pilotażowe, badanie to obejmuje 15 pacjentów, którzy zostaną poddani LT

Cele:

• Aby przetestować hipotezę, że u pacjentów de novo TAC otrzymujących mykofenolan mofetylu (MMF) i steroidy po LT istnieje odwrotna korelacja poziomów NFAT-RGE i TAC szczytowych 1,5 godziny po przyjęciu TAC
• Aby skorelować zarówno poziomy NFAT-RGE, jak i TAC (minimalne i szczytowe) z epizodami odrzucenia i skutkami ubocznymi TAC

Zbliżać się:

NFAT-RGE oznacza się u 15 pacjentów tuż przed LT i po LT po 1 dniu, 1 tygodniu, 2 tygodniach oraz po 1, 6 i 12 miesiącach.

Metody. Heparynizowaną krew obwodową stymulowano 1 ml kompletnej pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 100 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) i 5 μg/ml jonomycyny (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Po aktywacji immunologicznej ex vivo, po lizie krwinek czerwonych za pomocą buforu ACK (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), leukocyty poddaje się lizie za pomocą 400 mcl buforu do lizy MagNA-Pure uzupełnionego dodatkowym 1% (wag./obj.) ditiottrytu (RAS , Mannheim, Niemcy), a próbkę zamraża się w -70°C. Po rozmrożeniu mRNA izoluje się za pomocą zestawu RNA Blood mini Kit (Quiagen), stosując standardowy protokół mRNA dla komórek. RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji przy użyciu systemu syntezy pierwszej nici SuperScript III do RT-PCR (Invitrogen, technologie życia). Trzy geny regulowane przez NFAT (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) zostały zidentyfikowane jako geny odpowiednie dla tego eseju z poprzednich badań [18, 26]. Docelowe sekwencje mRNA IFN-γ, IL-2, GM-CSF i 3 genów referencyjnych amplifikuje się przy użyciu dostępnych w handlu testów PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay (Biorad) metodą cyfrowego PCR (Biorad).

RGE po przyjęciu TAC oblicza się jako cpeak/c0x100, gdzie c0 to dostosowana liczba transkryptów na poziomie TAC przed podaniem dawki, a cpeak to liczba transkryptów 1,5 (c1,5) godziny po przyjęciu leku.