NFAT-regulert genuttrykk etter takrolimus

Forsøket vil bli utført som en prospektiv, longitudinell studie. Studien er en enkeltsenterstudie utført ved Medical University of Graz, Department of Surgery, Division of Transplant Surgery og Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz.

Alle pasientene på LT-ventelisten ved Division of Transplant Surgery, Medical University of Graz blir screenet i henhold til både inklusjons- og eksklusjonskriterier. Studietiden er 1 år. Én NFAT-RGE baseline-måling utføres rett før LT; NFAT-RGE-målinger etter LT utføres på klart definerte tidspunkter.

Studiepopulasjon. Som en pilotstudie består denne studien av 15 pasienter som skal gjennomgå LT

Mål:

• For å teste hypotesen om at hos de-novo TAC-pasienter som får mykofenolatmofetil (MMF) og steroider etter LT, er det en omvendt korrelasjon mellom NFAT-RGE og TAC toppnivåer 1,5 timer etter TAC-inntak
• For å korrelere både NFAT-RGE og TAC (bunn og topp) nivåer med avvisningsepisoder og TAC-bivirkninger

Nærme seg:

NFAT-RGE bestemmes hos 15 pasienter like før LT, og etter LT etter 1 dag, 1 uke, 2 uker og etter 1, 6 og 12 måneder.

Metoder. Heparinisert perifert blod stimuleres med 1 ml komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium inneholdende 100 ng/ml forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og 5 mcg/ml ionomycin (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) i 3 timer ved 37°C. Etter ex vivo immunaktivering, etter lysering av røde blodlegemer med ACK-buffer (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), lyseres leukocytter med 400 mcl MagNA-Pure lyseringsbuffer supplert med ytterligere 1 % (W/v) ditiotritol (RAS) , Mannheim, Tyskland), og prøven fryses ved -70°C. Etter tining isoleres mRNA med RNA Blood mini Kit (Quiagen)-enheten ved å bruke mRNA-standardprotokollen for celler. RNA blir omvendt transkribert ved bruk av SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, life-teknologier). De 3 NFAT-regulerte genene (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) ble identifisert som egnede gener for dette essayet fra tidligere studier [18, 26]. Mål-mRNA-sekvenser av IFN-y, IL-2, GM-CSF og 3 referansegener blir amplifisert ved å bruke kommersielt tilgjengelige PrimePCR ddPCR-genekspresjonsprobeanalyser (Biorad) ved digital PCR (Biorad).

RGE etter TAC-inntak beregnes som cpeak/c0x100, hvor c0 er justert antall transkripsjoner ved TAC-predosenivå og cpeak er antall transkripsjoner 1,5 (c1,5) timer etter legemiddelinntak.