NFAT-regulierte Genexpression nach Tacrolimus

Die Studie wird als prospektive Längsschnittstudie durchgeführt. Die Studie ist eine monozentrische Studie, die an der Medizinischen Universität Graz, Universitätsklinik für Chirurgie, Abteilung für Transplantationschirurgie und der Abteilung für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin der Medizinischen Universität Graz durchgeführt wird.

Alle Patienten auf der LT-Warteliste der Klinischen Abteilung für Transplantationschirurgie der Medizinischen Universität Graz werden sowohl nach Ein- als auch nach Ausschlusskriterien gescreent. Die Studiendauer beträgt 1 Jahr. Eine NFAT-RGE-Baseline-Messung wird direkt vor LT durchgeführt; NFAT-RGE-Messungen nach LT werden zu klar definierten Zeitpunkten durchgeführt.

Studienpopulation. Als Pilotstudie umfasst diese Studie 15 Patienten, die sich einer LT unterziehen werden

Ziele:

• Um die Hypothese zu testen, dass es bei de novo TAC-Patienten, die Mycophenolatmofetil (MMF) und Steroide nach LT erhalten, eine inverse Korrelation der NFAT-RGE- und TAC-Spitzenspiegel 1,5 Stunden nach der TAC-Einnahme gibt
• Um sowohl NFAT-RGE- als auch TAC-Spiegel (Tal- und Spitzenwerte) mit Abstoßungsepisoden und TAC-Nebenwirkungen zu korrelieren

Ansatz:

NFAT-RGE wird bei 15 Patienten kurz vor LT und nach LT nach 1 Tag, 1 Woche, 2 Wochen und nach 1, 6 und 12 Monaten bestimmt.

Methoden. Heparinisiertes peripheres Blut wird mit 1 ml vollständigem Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium stimuliert, das 100 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und 5 mcg/ml Ionomycin (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis , MO, USA) für 3 Stunden bei 37°C. Nach der Ex-vivo-Immunaktivierung werden nach der Erythrozytenlyse mit ACK-Puffer (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3) die Leukozyten mit 400 mcl MagNA-Pure-Lysepuffer, ergänzt mit zusätzlich 1 % (w/v) Dithiothritol (RAS), lysiert , Mannheim, Deutschland), und die Probe wird bei -70°C eingefroren. Nach dem Auftauen wird die mRNA mit dem RNA Blood Mini Kit (Quiagen) unter Verwendung des mRNA-Standardprotokolls für Zellen isoliert. RNA wird unter Verwendung des SuperScript III First-Strand-Synthesesystems für RT-PCR (Invitrogen, Life Technologies) revers transkribiert. Die 3 NFAT-regulierten Gene (IFN-γ, IL-2, GM-CSF) wurden aus früheren Studien als geeignete Gene für diesen Aufsatz identifiziert [18, 26]. Ziel-mRNA-Sequenzen von IFN-γ, IL-2, GM-CSF und 3 Referenzgenen werden mit kommerziell erhältlichen PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assays (Biorad) durch digitale PCR (Biorad) amplifiziert.

Die RGE nach TAC-Einnahme wird als cpeak/c0x100 berechnet, wobei c0 die angepasste Anzahl von Transkripten auf dem TAC-Pegel vor der Dosis und cpeak die Anzahl von Transkripten 1,5 (c1,5) Stunden nach der Arzneimitteleinnahme ist.