NFAT-reguleret genekspression efter tacrolimus

Forsøget vil blive udført som et prospektivt, longitudinelt studie. Undersøgelsen er en enkelt-center undersøgelse udført på det medicinske universitet i Graz, afdelingen for kirurgi, afdelingen for transplantationskirurgi og afdelingen for blodgruppeserologi og transfusionsmedicin, det medicinske universitet i Graz.

Alle patienter på LT-ventelisten ved afdelingen for transplantationskirurgi, Medical University of Graz, screenes i henhold til både inklusions- og eksklusionskriterier. Studietiden er 1 år. Én NFAT-RGE baseline-måling udføres direkte før LT; NFAT-RGE-målinger efter LT udføres på klart definerede tidspunkter.

Studiepopulation. Som et pilotforsøg består denne undersøgelse af 15 patienter, som skal gennemgå LT

Mål:

• For at teste hypotesen om, at der hos de-novo TAC-patienter, der får mycophenolatmofetil (MMF) og steroider efter LT, er en omvendt korrelation mellem NFAT-RGE og TAC-peakniveauer 1,5 time efter TAC-indtagelse
• At korrelere både NFAT-RGE og TAC (bund og peak) niveauer med afvisningsepisoder og TAC bivirkninger

Nærme sig:

NFAT-RGE bestemmes hos 15 patienter lige før LT og efter LT efter 1 dag, 1 uge, 2 uger og efter 1, 6 og 12 måneder.

Metoder. Hepariniseret perifert blod stimuleres med 1 ml komplet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 100 ng/ml phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og 5 mcg/ml ionomycin (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis , MO, USA) i 3 timer ved 37°C. Efter ex vivo immunaktivering, efter lysering af røde blodlegemer med ACK-buffer (0,15 M NH4CL, 1,0 mM KHCO3), lyseres leukocytter med 400 mcl MagNA-Pure lysisbuffer suppleret med yderligere 1 % (vægt/volumen) dithiothritol (RAS) , Mannheim, Tyskland), og prøven fryses ved -70°C. Efter optøning isoleres mRNA med RNA Blood mini Kit (Quiagen)-enheden ved hjælp af mRNA-standardprotokollen for celler. RNA transskriberes omvendt ved hjælp af SuperScript III First-Strand Synthesis System til RT-PCR (Invitrogen, life-teknologier). De 3 NFAT-regulerede gener (IFN-y, IL-2, GM-CSF) blev identificeret som egnede gener til dette essay fra tidligere undersøgelser [18, 26]. Mål-mRNA-sekvenser af IFN-y-, IL-2-, GM-CSF- og 3-referencegener amplificeres under anvendelse af kommercielt tilgængelige PrimePCR ddPCR-genekspressionsprobeassays (Biorad) ved digital PCR (Biorad).

RGE efter TAC-indtagelse beregnes som cpeak/c0x100, hvor c0 er det justerede antal transskriptioner ved TAC-prædosisniveauet, og cpeak er antallet af transkriptioner 1,5 (c1,5) timer efter lægemiddelindtagelse.