Suplementace L-ornitinem, ale ne L-argininem zvyšuje hustotu CD68+ a CD163+ makrofágů u parodontitidy

Návrh studie Tato práce byla původní výzkumnou studií. Do studie bylo zařazeno 75 jedinců s diagnózou generalizované parodontitidy ve stadiu II-III a stupně B (38 žen a 37 mužů, 51 %, resp. 49 %). Paradentóza byla diagnostikována podle kritérií Klasifikace parodontálních a periimplantátových onemocnění a stavů 2017. Stádium II parodontitidy bylo diagnostikováno v přítomnosti 3 až 4 mm mezizubního CAL v místě největší ztráty, 4 až maximálně 5 mm PPD, radiografického úbytku kostní hmoty v kořenové koronální třetině a bez ztráty zubu v důsledku parodontitidy. Stádium III bylo diagnostikováno v přítomnosti ≥5 mm interdentální CAL, radiografický úbytek kostní hmoty zasahující do střední nebo apikální třetiny kořene, ztráta ≤4 zubů v důsledku parodontitidy. Ve všech případech měla parodontitida generalizovaný obraz (>30 % postižených zubů) a stupeň B jako vzorce progrese na základě nepřímých důkazů (radiografický úbytek kostní hmoty vyjádřený jako procento délky kořene děleno věkem subjektu bylo od 0,25 až 1,0).

Pacienti byli seskupeni stratifikovanou randomizací do tří skupin: skupina SRP (pacienti podstoupili škálování a hoblování kořenů jako proceduru s plnými ústy, n=25); skupina Arg (pacienti dostávali orálně L-arginin aspartát (Yuria-Pharm, Ukrajina) v dávce 1 g t.i.d. po dobu 10 dnů po SRP, n=25); a skupina Orn (pacienti dostávali orálně L-ornitin aspartát (Farmak, Ukrajina) v dávce 3 g t.i.d. po dobu 15 dnů po SRP, n=25). Použili jsme arginin a ornitin podle pokynů pro tyto léky dostupné pro použití na Ukrajině. Během studie byli všichni pacienti na stabilní dietě, aniž by měnili své krmné dávky a režimy.

U všech účastníků bylo zaznamenáno pohlaví a věk a měření periodontálních parametrů, jako je hloubka periodontální kapsy (PPD), úroveň klinického přilnutí (CAL) a krvácení při sondování (BoP), byla odebrána ze šesti periodontálních míst na všech zubech (kromě třetího moláry) jedním kalibrovaným vyšetřujícím za použití ruční periodontální sondy (nástroj zubního průzkumníka označený 0106.DT06.CP10, Den Tag, Itálie). PPD a CAL byly měřeny s přesností na 1 mm.

Všichni pacienti byli klinicky vyšetřeni před léčbou a po 1 měsíci ± 5 dnů.

Odběr vzorků gingivální tkáně Pro přesnou imunohistochemickou studii byla gingivální biopsie přibližně 3x3 mm vyříznuta v lokální anestezii před léčbou a 1 měsíc později u 5 vybraných pacientů na skupinu. Biopsie byly získány ve stejných časových bodech, z jednoho místa s nejhlubší kapsou kolem vhodných zubních a parodontologických zákroků. Odstranění těchto tkáňových biopsií nezasahovalo do počátečního léčebného plánu ani neovlivnilo očekávané klinické výsledky. Po odběru byly biopsie fixovány ve 4% roztoku formalínu po dobu 24 hodin fixace, dehydratovány a zality v parafínu.

Imunohistochemie a protilátky Parafinové řezy o tloušťce 2-3 μm byly zbaveny parafinu a dehydratovány. Tepelně indukované vyhledávání epitopu v citrátovém pufru, síla vodíku (pH) 6, bylo provedeno postupným zahřátím sklíček v mikrovlnné troubě, poté ponecháno vychladnout, propláchnuto fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), inkubováno s blokovaným činidlem, propláchnuto a inkubovány s myšími monoklonálními CD68 protilátkami (1:30, klon PG-M1, Diagnostic BioSystems, Haag, Nizozemsko) nebo anti-CD163 (1:100, klon 10D6, Diagnostic BioSystems, Haag, Nizozemsko). Poté byly řezy obarveny 2-krokovým detekčním systémem Mouse/Rabbit PolyVue Plus™ HRP/DAB (Diagnostic BioSystems, Haag, Nizozemsko) a kontrastně obarveny Mayerovým hemalaunem. PBS byl použit jako negativní kontrola, tkáň lymfatických uzlin - jako pozitivní kontrola.

Vyhodnocení imunohistochemického barvení CD68+ a CD163+ makrofágy (Mφs) byly odhadnuty spočítáním počtu buněk světelným mikroskopem × 400 v intenzivních infiltračních oblastech, bylo vybráno 5 oblastí z každého řezu a všech 5 počtů bylo vzato pro statistiku. Počítali jsme imunopozitivní Mφ v oblastech buněčné infiltrace, protože přímo souvisí se zánětem. Počet buněk na 10 000 μm2 byl vypočten jako hustota imunopozitivních buněk. Fotografie byly získány pomocí světelného mikroskopu Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Göttingen, Německo) (×400).

Statistická analýza Malá velikost vzorku byla odůvodněna očekáváním velké velikosti účinku, neznámého nulového rozdělení a kompenzována adekvátní neparametrickou statistikou výkonu. Přesný výpočet velikosti vzorku nebyl proveden.

Průměry PPD a CAL byly vypočteny pro místa s PD > 4 mm (postižená místa). Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA) pomocí deskriptivní statistiky, chí-kvadrát testu, jednocestné ANOVA a neparametrických testů ANOVA pro vícenásobné srovnání: Friedman - pro závislé proměnné, Kruskal-Wallis test - pro nezávislé proměnné, s post-hoc analýzou. Pro popisnou statistiku počtu buněk byly také použity percentilové rozsahy kvůli nenormálním distribucím. Poměr CD68+/CD163+ byl hodnocen meziskupinovými t-testy a kontrolami Spearmanovy korelace. P hodnoty