A suplementação com L-ornitina, mas não com L-arginina, aumenta a densidade de macrófagos CD68+ e CD163+ na periodontite

Desenho do estudo O presente trabalho foi o estudo de pesquisa original. 75 indivíduos com diagnóstico de periodontite generalizada nos estágios II-III e grau B (38 mulheres e 37 homens, 51% e 49%, respectivamente) foram incluídos no estudo. A periodontite foi diagnosticada usando os critérios da Classificação de Doenças e Condições Periodontais e Peri-implantares 2017. O estágio II da periodontite foi diagnosticado na presença de CAL interdental de 3 a 4 mm no local de maior perda, PPD de 4 a 5 mm no máximo, perda óssea radiográfica no terço coronal da raiz e ausência de perda dentária devido à periodontite. O estágio III foi diagnosticado na presença de ≥ 5 mm de CAL interdental, a perda óssea radiográfica estendendo-se até o terço médio ou apical da raiz, ≤ 4 dentes perdidos devido à periodontite. Em todos os casos, a periodontite teve um padrão generalizado (>30% dos dentes envolvidos) e grau B como padrões de progressão, com base em evidências indiretas (a perda óssea radiográfica expressa como uma porcentagem do comprimento da raiz dividida pela idade do indivíduo foi de 0,25 a 1,0).

Os pacientes foram agrupados por randomização estratificada em três grupos: o Grupo SRP (os pacientes receberam raspagem e alisamento radicular como um procedimento de boca inteira, n=25); o Grupo Arg (pacientes receberam aspartato de L-arginina oral (Yuria-Pharm, Ucrânia) na dose de 1 g t.i.d. por 10 dias após SRP, n=25); e o Grupo Orn (pacientes receberam aspartato de L-ornitina oral (Farmak, Ucrânia) na dose de 3 g t.i.d. por 15 dias após SRP, n=25). Usamos arginina e ornitina de acordo com as instruções desses medicamentos disponíveis para uso na Ucrânia. Durante o estudo, todos os pacientes estavam em uma dieta estável, sem alterar suas rações e regimes.

Para todos os participantes, gênero e idade foram registrados, e parâmetros periodontais como profundidade de bolsa periodontal (PPD), nível de inserção clínica (CAL) e sangramento à sondagem (BoP) foram medidos em seis sítios periodontais em todos os dentes (exceto para o terceiro molares) por um único examinador calibrado usando uma sonda periodontal manual (dental explorer tool rotulado 0106.DT06.CP10, Den Tag, Itália). PPD e CAL foram medidos para o 1 mm mais próximo.

Todos os pacientes foram examinados clinicamente antes do tratamento e após 1 mês ± 5 dias.

Coleta de amostras de tecido gengival Para o estudo imuno-histoquímico preciso, a biópsia gengival de aproximadamente 3x3 mm foi excisada sob anestesia local antes do tratamento e 1 mês depois em 5 pacientes selecionados por grupo. As biópsias foram obtidas nos mesmos pontos de tempo, de um único local exibindo a bolsa mais profunda em torno de procedimentos dentários e periodontais adequados. A remoção dessas biópsias de tecido não interferiu no plano de tratamento inicial nem influenciou nos resultados clínicos esperados. Após a coleta, as biópsias foram fixadas em solução de formol a 4% por 24 horas de fixação, desidratadas e embebidas em parafina.

Imuno-histoquímica e anticorpos Cortes de parafina com 2-3 μm de espessura foram desparafinizados e desidratados. A recuperação de epítopos induzida por calor em tampão citrato, potência de hidrogênio (pH) 6, foi realizada por aquecimento sucessivo das lâminas no forno de micro-ondas, depois resfriadas, enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), incubadas com reagente bloqueado, enxaguadas , e incubados com anticorpos CD68 monoclonais de camundongo (1:30, clone PG-M1, Diagnostic BioSystems, Haia, Holanda) ou anti-CD163 (1:100, clone 10D6, Diagnostic BioSystems, Haia, Holanda). Em seguida, as seções foram coradas com o sistema de detecção HRP/DAB de 2 etapas Mouse/Rabbit PolyVue Plus™ (Diagnostic BioSystems, Haia, Holanda) e contrastadas com haemalaun de Mayer. O PBS foi usado como controle negativo, o tecido do linfonodo - como controle positivo.

Avaliação da coloração imuno-histoquímica Macrófagos CD68+ e CD163+ (Mφs) foram estimados pela contagem do número de células por microscópio de luz × 400 em áreas infiltrativas intensivas, 5 regiões de cada corte foram selecionadas e todas as 5 contagens foram feitas para estatísticas. Contamos Mφs imunopositivos nas áreas de infiltração celular, pois estão diretamente relacionados à inflamação. O número de células por 10 000 μm2 foi calculado como densidade celular imunopositiva. As fotos foram obtidas usando o microscópio de luz Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha) (×400).

Análise estatística O pequeno tamanho da amostra foi justificado pela expectativa de um tamanho de efeito alto, distribuição nula desconhecida e compensada com estatísticas não paramétricas de poder adequado. O cálculo preciso do tamanho da amostra não foi realizado.

As médias de PPD e CAL foram calculadas para locais com PD>4mm (locais afetados). A análise estatística foi realizada no software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EUA) por meio de estatística descritiva, teste qui-quadrado, ANOVA one-way e testes ANOVA não paramétricos para comparações múltiplas: Friedman - para variáveis ​​dependentes, Kruskal-Wallis teste - para variáveis ​​independentes, com análise post-hoc. Para estatísticas descritivas de números de células, os intervalos de percentil também foram usados ​​devido a distribuições não normais. A relação CD68+/CD163+ foi avaliada por comparações de testes t intergrupos e verificação de correlação de Spearman. valores P de