Добавление L-орнитина, но не L-аргинина, увеличивает плотность макрофагов CD68+ и CD163+ при пародонтите

Дизайн исследования Настоящая работа была оригинальным исследованием. В исследование включено 75 человек с диагнозом генерализованный пародонтит II-III стадии и степени Б (38 женщин и 37 мужчин, 51% и 49% соответственно). Пародонтит был диагностирован с использованием критериев Классификации пародонтальных и периимплантационных заболеваний и состояний 2017 года. Стадия II пародонтита была диагностирована при наличии межзубной CAL от 3 до 4 мм в месте наибольшей потери, PPD от 4 до максимум 5 мм, рентгенологической потери кости в коронковой трети корня и отсутствии потери зубов из-за периодонтита. Стадию III диагностировали при наличии межзубного CAL ≥5 мм, рентгенологической потери костной массы, распространяющейся на среднюю или апикальную треть корня, потере ≤4 зубов вследствие периодонтита. Во всех случаях периодонтит имел генерализованный характер (>30% пораженных зубов) и степень В как характер прогрессирования, основанный на косвенных доказательствах (рентгенографическая потеря кости, выраженная в процентах от длины корня, деленная на возраст субъекта, была от от 0,25 до 1,0).

Пациенты были сгруппированы методом стратифицированной рандомизации в три группы: группа SRP (пациенты получили скейлинг и полировку корней в качестве полноротовой процедуры, n = 25); группа Arg (пациенты получали перорально L-аргинина аспартат («Юрия-Фарм», Украина) в дозе 1 г 3 раза в день в течение 10 дней после СРП, n=25); группа Орн (пациенты получали перорально L-орнитина аспартат («Фармак», Украина) в дозе 3 г 3 раза в день в течение 15 дней после ПРП, n=25). Мы применяли аргинин и орнитин согласно инструкции к этим препаратам, доступным для применения в Украине. В ходе исследования все больные находились на стабильном питании, без изменения рационов и режимов.

Для всех участников регистрировались пол и возраст, а параметры пародонта, такие как глубина пародонтального кармана (PPD), уровень клинического прикрепления (CAL) и кровоточивость при зондировании (BoP), измерялись в шести участках пародонта на всех зубах (кроме третьего). моляры) одним калиброванным исследователем с использованием ручного периодонтального зонда (зубной зонд с маркировкой 0106.DT06.CP10, Den Tag, Италия). PPD и CAL измерялись с точностью до 1 мм.

Все больные были клинически обследованы до лечения и через 1 мес ± 5 дней.

Сбор образцов ткани десны Для точного иммуногистохимического исследования у 5 отобранных пациентов в каждой группе под местной анестезией иссекали биопсию десны размером примерно 3x3 мм до лечения и через 1 месяц. Биопсии были получены в одни и те же моменты времени из одного участка, демонстрирующего самый глубокий карман вокруг подходящих стоматологических и пародонтальных процедур. Удаление этих биопсий тканей не мешало первоначальному плану лечения и не влияло на ожидаемые клинические результаты. После сбора биоптаты фиксировали в 4% растворе формалина в течение 24 ч фиксации, обезвоживали и заливали в парафин.

Иммуногистохимия и антитела Парафиновые срезы толщиной 2-3 мкм депарафинизировали и обезвоживали. Выделение эпитопа, индуцированное нагреванием, в цитратном буфере, степень водорода (pH) 6, проводили путем последовательного нагрева предметных стекол в микроволновой печи, затем давали остыть, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), инкубировали с блокированным реагентом, промывали и инкубировали с мышиными моноклональными антителами к CD68 (1:30, клон PG-M1, Diagnostic BioSystems, Гаага, Нидерланды) или анти-CD163 (1:100, клон 10D6, Diagnostic BioSystems, Гаага, Нидерланды). Затем срезы окрашивали с помощью двухэтапной системы обнаружения HRP/DAB PolyVue Plus™ для мышей/кроликов (Diagnostic BioSystems, Гаага, Нидерланды) и докрашивали гемалауном Майера. В качестве отрицательного контроля использовали PBS, в качестве положительного контроля – ткань лимфатического узла.

Оценка иммуногистохимического окрашивания CD68+ и CD163+ макрофагов (Mφs) оценивали путем подсчета количества клеток под световым микроскопом ×400 в зонах интенсивной инфильтрации, из каждого среза выбирали 5 участков и все 5 подсчетов брали для статистики. Мы подсчитывали иммунопозитивные Мф в зонах клеточной инфильтрации, так как они имеют прямое отношение к воспалению. Количество клеток на 10 000 мкм2 рассчитывали как плотность иммунопозитивных клеток. Фотографии получены с помощью светового микроскопа Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Гёттинген, Германия) (×400).

Статистический анализ Небольшой размер выборки был оправдан ожиданием высокого размера эффекта, неизвестного нулевого распределения и компенсирован адекватной мощностью непараметрической статистики. Точный расчет объема выборки не проводился.

Средние значения PPD и CAL были рассчитаны для участков с PD>4 мм (пораженные участки). Статистический анализ выполнен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Сан-Диего, США) методами описательной статистики, критерия хи-квадрат, однофакторного дисперсионного анализа и непараметрического дисперсионного анализа для множественных сравнений: Фридмана - для зависимых переменных, Крускала-Уоллиса. test - для независимых переменных, с апостериорным анализом. Для описательной статистики количества клеток также использовались диапазоны процентилей из-за ненормального распределения. Соотношение CD68+/CD163+ оценивали путем сравнения межгрупповых t-тестов и проверки корреляции Спирмена. P значения