Suplementacja L-ornityną, ale nie L-argininą zwiększa gęstość makrofagów CD68+ i CD163+ w zapaleniu przyzębia

Projekt badania Niniejsza praca była oryginalnym badaniem badawczym. Do badania włączono 75 osób z rozpoznaniem uogólnionego zapalenia przyzębia w stopniu zaawansowania II-III i B (38 kobiet i 37 mężczyzn, odpowiednio 51% i 49%). Zapalenie przyzębia rozpoznano na podstawie kryteriów Klasyfikacji Chorób i Schorzeń Przyzębia i Wokół Implantów 2017. Stopień II zapalenia przyzębia rozpoznano na podstawie 3-4 mm CAL międzyzębowego w miejscu największego ubytku, 4-5 mm PPD, radiograficznego ubytku kości w części koronowej korzenia i braku utraty zęba z powodu zapalenia przyzębia. Stopień III rozpoznano w przypadku CAL międzyzębowego ≥5 mm, ubytku kości w badaniu radiograficznym sięgającym do środkowej lub wierzchołkowej trzeciej części korzenia, utraty ≤4 zębów z powodu zapalenia przyzębia. We wszystkich przypadkach zapalenie przyzębia charakteryzowało się uogólnieniem (>30% zajętych zębów) i stopniem B jako wzorcami progresji, na podstawie dowodów pośrednich (utrata kości w badaniu radiograficznym wyrażona jako procent długości korzeni podzielony przez wiek pacjenta wynosiła od 0,25 do 1,0).

Pacjenci zostali podzieleni na trzy grupy metodą stratyfikowanej randomizacji: grupa SRP (pacjenci otrzymali skaling i wyrównywanie korzeni jako zabieg całej jamy ustnej, n=25); grupa Arg (pacjenci otrzymywali doustnie asparaginian L-argininy (Yuria-Pharm, Ukraina) w dawce 1 g trzy razy dziennie przez 10 dni po SRP, n=25); oraz Grupa Orn (pacjenci otrzymywali doustnie asparaginian L-ornityny (Farmak, Ukraina) w dawce 3 g trzy razy dziennie przez 15 dni po SRP, n=25). Stosowaliśmy argininę i ornitynę zgodnie z instrukcjami dla tych leków dostępnych do stosowania na Ukrainie. Podczas badania wszyscy pacjenci stosowali stabilną dietę, bez zmiany racji i reżimów żywieniowych.

Dla wszystkich uczestników zarejestrowano płeć i wiek, a parametry przyzębia, takie jak głębokość kieszonek przyzębnych (PPD), kliniczny poziom przyczepu (CAL) i pomiary krwawienia przy sondowaniu (BoP) wykonano w sześciu miejscach przyzębia na wszystkich zębach (z wyjątkiem trzeciego zębów trzonowych) przez jednego skalibrowanego egzaminatora przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej (narzędzie Dental Explorer oznaczone 0106.DT06.CP10, Den Tag, Włochy). PPD i CAL mierzono z dokładnością do 1 mm.

Wszyscy pacjenci zostali poddani badaniu klinicznemu przed leczeniem oraz po 1 miesiącu ± 5 dniach.

Pobieranie próbek tkanek dziąseł W celu przeprowadzenia dokładnych badań immunohistochemicznych, biopsja dziąsła o wielkości około 3x3 mm została wycięta w znieczuleniu miejscowym przed leczeniem i 1 miesiąc później u 5 wybranych pacjentów z grupy. Biopsje uzyskano w tych samych punktach czasowych, z jednego miejsca wykazującego najgłębszą kieszonkę wokół odpowiednich zabiegów dentystycznych i periodontologicznych. Usunięcie tych biopsji tkankowych nie kolidowało z pierwotnym planem leczenia ani nie wpłynęło na oczekiwane wyniki kliniczne. Po pobraniu biopsje utrwalono w 4% roztworze formaliny na 24 godziny utrwalania, odwodniono i zatopiono w parafinie.

Immunohistochemia i przeciwciała Skrawki parafinowe o grubości 2-3 μm odparafinowano i odwodniono. Wywołane ciepłem odzyskiwanie epitopów w buforze cytrynianowym, moc wodoru (pH) 6, przeprowadzono przez kolejne ogrzewanie szkiełek w kuchence mikrofalowej, następnie pozostawiono do ostygnięcia, przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), inkubowano z zablokowanym odczynnikiem, przepłukano i inkubowano z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi CD68 (1:30, klon PG-M1, Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia) lub anty-CD163 (1:100, klon 10D6, Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia). Następnie skrawki barwiono dwuetapowym systemem wykrywania mysz/królik PolyVue Plus™ HRP/DAB Detection System (Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia) i barwiono kontrastowo hemalaunem Mayera. PBS zastosowano jako kontrolę negatywną, tkankę węzłów chłonnych - jako kontrolę pozytywną.

Ocena barwienia immunohistochemicznego makrofagów CD68 + i CD163 + (Mφ) oszacowano przez zliczenie liczby komórek za pomocą mikroskopu świetlnego × 400 w obszarach intensywnej infiltracji, wybrano 5 regionów z każdego skrawka i wszystkie 5 zliczeń pobrano do statystyk. Policzyliśmy immunopozytywne Mφ w obszarach nacieku komórkowego, ponieważ są one bezpośrednio związane ze stanem zapalnym. Liczbę komórek na 10 000 μm2 obliczono jako gęstość komórek immunopozytywnych. Zdjęcia uzyskano przy użyciu mikroskopu świetlnego Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Getynga, Niemcy) (×400).

Analiza statystyczna Mała wielkość próby była uzasadniona oczekiwaniem dużej wielkości efektu, nieznanego rozkładu zerowego i skompensowana odpowiednimi mocowymi statystykami nieparametrycznymi. Nie przeprowadzono dokładnego obliczenia wielkości próby.

Średnie PPD i CAL obliczono dla miejsc z PD>4 mm (miejsca dotknięte chorobą). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA) za pomocą statystyki opisowej, testu chi-kwadrat, jednokierunkowej analizy ANOVA oraz nieparametrycznej analizy porównań wielokrotnych: Friedmana – dla zmiennych zależnych, Kruskala-Wallisa test - dla zmiennych niezależnych, z analizą post-hoc. W przypadku statystyk opisowych liczby komórek zastosowano również zakresy percentylowe ze względu na rozkłady inne niż normalne. Stosunek CD68+/CD163+ oceniono za pomocą porównań międzygrupowych testów t i sprawdzenia korelacji Spearmana. wartości P