L'integrazione con L-ornitina ma non con L-arginina aumenta la densità dei macrofagi CD68+ e CD163+ nella parodontite

Disegno dello studio Il presente lavoro è stato lo studio di ricerca originale. Sono stati inclusi nello studio 75 soggetti con diagnosi di parodontite generalizzata agli stadi II-III e grado B (38 donne e 37 uomini, rispettivamente 51% e 49%). La parodontite è stata diagnosticata utilizzando i criteri della Classificazione delle malattie e condizioni parodontali e perimplantari 2017. Lo stadio II della parodontite è stato diagnosticato in presenza di CAL interdentale da 3 a 4 mm nel sito di maggiore perdita, PPD da 4 a massimo 5 mm, perdita ossea radiografica al terzo coronale della radice e nessuna perdita di denti dovuta a parodontite. Lo stadio III è stato diagnosticato in presenza di CAL interdentale ≥5 mm, perdita ossea radiografica che si estendeva al terzo medio o apicale della radice, perdita di denti ≤4 dovuta a parodontite. In tutti i casi, la parodontite presentava un pattern generalizzato (>30% dei denti coinvolti) e un grado B come pattern di progressione, sulla base di prove indirette (la perdita ossea radiografica espressa come percentuale della lunghezza della radice divisa per l'età del soggetto era da da 0,25 a 1,0).

I pazienti sono stati raggruppati per randomizzazione stratificata in tre gruppi: il gruppo SRP (i pazienti hanno ricevuto detartrasi e levigatura radicolare come procedura full-mouth, n=25); il gruppo Arg (i pazienti hanno ricevuto L-arginina aspartato per via orale (Yuria-Pharm, Ucraina) alla dose di 1 g t.i.d. per 10 giorni dopo SRP, n=25); e il gruppo Orn (i pazienti hanno ricevuto L-ornitina aspartato orale (Farmak, Ucraina) alla dose di 3 g t.i.d. per 15 giorni dopo SRP, n=25). Abbiamo usato arginina e ornitina secondo le istruzioni per questi medicinali disponibili per l'uso in Ucraina. Durante lo studio, tutti i pazienti seguivano una dieta stabile, senza cambiare razioni e reggimenti.

Per tutti i partecipanti sono stati registrati sesso ed età e parametri parodontali come la profondità della tasca parodontale (PPD), il livello di attacco clinico (CAL) e le misurazioni del sanguinamento al sondaggio (BoP) sono stati presi da sei siti parodontali su tutti i denti (ad eccezione del terzo molari) da un singolo esaminatore calibrato utilizzando una sonda parodontale manuale (strumento di esplorazione dentale etichettato 0106.DT06.CP10, Den Tag, Italia). PPD e CAL sono stati misurati con l'approssimazione di 1 mm.

Tutti i pazienti sono stati esaminati clinicamente prima del trattamento e dopo 1 mese ± 5 giorni.

Raccolta di campioni di tessuto gengivale Per lo studio immunoistochimico preciso, la biopsia gengivale di circa 3x3 mm è stata asportata in anestesia locale prima del trattamento e 1 mese dopo in 5 pazienti selezionati per gruppo. Le biopsie sono state ottenute negli stessi punti temporali, da un singolo sito che mostrava la tasca più profonda attorno a procedure dentali e parodontali idonee. La rimozione di queste biopsie tissutali non ha interferito con il piano di trattamento iniziale né ha influenzato i risultati clinici attesi. Dopo la raccolta, le biopsie sono state fissate in una soluzione di formalina al 4% per 24 ore di fissazione, disidratate e incorporate in paraffina.

Immunoistochimica e anticorpi Le sezioni in paraffina, di 2-3 μm di spessore, sono state deparaffinate e disidratate. Il recupero dell'epitopo indotto dal calore in tampone citrato, potere di idrogeno (pH) 6, è stato eseguito riscaldando successivamente i vetrini nel forno a microonde, quindi lasciato raffreddare, risciacquato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), incubato con reagente bloccato, risciacquato e incubato con anticorpi CD68 monoclonali di topo (1:30, clone PG-M1, Diagnostic BioSystems, L'Aia, Paesi Bassi) o anti-CD163 (1:100, clone 10D6, Diagnostic BioSystems, L'Aia, Paesi Bassi). Quindi le sezioni sono state colorate con il sistema di rilevamento HRP/DAB PolyVue Plus™ Mouse/Rabbit a 2 fasi (Diagnostic BioSystems, L'Aia, Paesi Bassi) e controcolorate con l'haemalaun di Mayer. PBS è stato usato come controllo negativo, il tessuto linfonodale come controllo positivo.

Valutazione della colorazione immunoistochimica I macrofagi CD68 + e CD163 + (Mφ) sono stati stimati contando il numero di cellule al microscopio ottico × 400 in aree infiltrative intensive, sono state selezionate 5 regioni da ciascuna fetta e tutti e 5 i conteggi sono stati presi per le statistiche. Abbiamo contato Mφ immunopositivi nelle aree di infiltrazione cellulare, poiché sono direttamente correlati all'infiammazione. Il numero di cellule per 10.000 μm2 è stato calcolato come densità cellulare immunopositiva. Le foto sono state ottenute utilizzando il microscopio ottico Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Göttingen, Germania) (×400).

Analisi statistica La piccola dimensione del campione è stata giustificata dall'aspettativa di un'elevata dimensione dell'effetto, distribuzione nulla sconosciuta e compensata con statistiche non parametriche di potenza adeguate. Non è stato eseguito un calcolo preciso della dimensione del campione.

Le medie di PPD e CAL sono state calcolate per i siti con PD>4 mm (siti interessati). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA) mediante statistiche descrittive, test chi-quadrato, ANOVA unidirezionale e test ANOVA non parametrici per confronti multipli: Friedman - per variabili dipendenti, Kruskal-Wallis test - per variabili indipendenti, con analisi post-hoc. Per le statistiche descrittive dei numeri di celle, sono stati utilizzati anche gli intervalli percentili a causa di distribuzioni non normali. Il rapporto CD68+/CD163+ è stato valutato mediante confronti t-test intergruppo e verifica della correlazione di Spearman. Valori P di