Účinky Allium Sativum a extraktu Moringa Oleifera na zubní sklovinu

Tato experimentální studie na zvířatech bude provedena ve Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) a COMSATS University, Lahore. Pro tuto studii se do studie vezme padesát čtyři zdravých samců bílých novozélandských králíků (9 až 10 týdnů). Králíci budou náhodně rozděleni do 6 skupin. Velikost vzorku bude 9 králíků v každé skupině. Pokusná zvířata budou přidělena pomocí generátoru náhodných čísel číslem 1,2,3,4, až 54 a budou náhodně rozdělena do šesti skupin (n=9) a budou zařazena do skupin A, B, C, D, E a F. Zdraví samci, bílí novozélandští králíci o hmotnosti 1000-1200 gramů (věk 9-10 týdnů) budou vybráni z University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore. Zvířata budou přemístěna do zvířátka UHS. Zvířata budou chována v experimentální výzkumné laboratoři při kontrolované pokojové teplotě (22-24°C) a vlhkosti (45-65 %) pod 12/12 hodinovým cyklem přirozeného světla a tmy po dobu 2 týdnů, aby se aklimatizovala v novém prostředí. Všechna pokusná zvířata budou krmena zeleninou, ovocem a destilovanou vodou ad libitum. Na konci 12 týdnů budou všechna zvířata utracena v hluboké anestezii. Ketamin hydrochlorid 45 mg/kg tělesné hmotnosti a xylazin 5 mg/kg tělesné hmotnosti I/M bude podáván k udržení hluboké anestezie. Poté bylo 20 mg xylazinu injikováno do malíkové žíly k usmrcení králíků, když byli anestetizováni.(35).

Odběr krve: Centrální ušní tepna (36) nebo laterální saféna budou vybrány pro odběr 4 ml krve v den 0, po 8 týdnech a na konci 12 týdnů. Vzorek bude odebrán do zkumavky pro separaci séra pro vyšetření, jako je počet olova v krvi, alkalická fosfatáza, hladina vápníku a fosfátu.

Technika odběru vzorků tkáně:

K vyšetření bude odebrána část 4x5 mm2 ze střední třetiny korunkové labiální plochy. Řezání bude provedeno diamantovým kotoučem a vysokorychlostní turbínou se zavlažováním vodou, aby nedošlo k přehřátí vzorku. Pro SEM a AFM budou vybrány pravé dolní řezáky všech králíků. Levé mandibulární řezáky všech králíků budou selektovány SEM-EDX a RMS analýzou. Všechny vzorky budou označeny a uloženy ve sterilizované nádobě s 12% formalínem po dobu 72 hodin.

Laboratorní zpracování:

1. Skenovací elektronová mikroskopie: Pro SEM analýzu bude vybrán pravý mandibulární řezák. Struktura a morfologické rysy skloviny budou patrné z jejích obrázků. Vzorek se promyje destilovanou vodou a vysuší horkovzdušným ventilátorem při pomalé rychlosti. Na bodnutí vzorku lze najednou fixovat šestnáct vzorků. Vzorky budou upevněny na bodnutí dvojitou měděnou páskou. Odkryté bodnutí bude rovněž překryto měděnou páskou a pouze část vzorku zůstane nezakrytá.

   Povlak zlata bude proveden v rozprašovacím stroji, aby se vytvořil povrchový vodič pro jemné detaily snímků. Bodnutí vzorku bude umístěno do komory rozprašovacího stroje a víko bude uzavřeno. Uvnitř komory se vytvoří vakuum a naplní se plynný argon. Bude dán potenciál 40 voltů. Tím se uvnitř komory vytvoří plazma a elektrony argonového plynu budou narážet na zlatou desku. Drobné zlaté částečky začnou při bodnutí vzorku prskat. Jakmile bude zlaté potažení provedeno, postup se obrátí. Komora se naplní vzduchem a víko se otevře. Nyní bude vzorek zpracován v NOVA NANOSEM 450 pro ultrastrukturální detaily.

2. Energetická disperzní spektroskopie: EDX bude použit ke studiu elementárního složení minerálních látek. K NOVA NANOSEM 450 bude připojen detektor OXFORD X-ACT, PENTA FET. Stejný vzorek použitý pro SEM bude také použit pro analýzu SEM-EDX. To poskytne detaily na povrchu až do tloušťky 2 mikrony.

3. Mikroskop atomových sil: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japonsko) bude použit pro hodnocení morfologických vlastností povrchu skloviny. Poskytuje trojrozměrnou topografii povrchu bez jakékoli přípravy vzorku. Tato mikroskopie je určena ke skenování vzorku pomocí sondy. Vzorek bude připevněn na pahýl, který bude upevněn a ručně upraven. Nastavení laseru bude provedeno po určení frekvence sondy. Nakonec bude skenování a zpracování obrazu provedeno systémem WinSPM. Pro jeden reprezentativní vzorek budou pořízeny mikrofotografie v šesti různých oblastech (skenovací plocha 2,0 × 2,0 μm) pomocí softwaru AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japonsko) a AFM softwaru (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japonsko).

   AFM vytváří 3D obrazy povrchu skenováním konzoly o velikosti mikronů přes povrch, který je obvykle vyroben z křemíku nebo nitridu křemíku, s hrotem, jehož poloměr zakřivení je ~10 nm. Konzola je vychylována silami mezi špičkou a povrchem, které jsou ~nN a zahrnují příspěvky elektrostatických sil, solvatačních sil, Vander Waalsových interakcí a chemických vazeb. Toto vychýlení konzoly je měřeno laserovým bodem odrážejícím se od horního povrchu konzoly do pole fotodiod, které poskytuje obrazy na počítači.

4. Ramanova spektroskopie: Je to nedestruktivní technika chemické analýzy, která poskytuje podrobné informace o chemické struktuře, krystalinitě a molekulárních interakcích. RMS nám poskytne podrobnosti o celé tloušťce skloviny o molekulárním složení a jeho interakci se vzorkem. Pro tuto analýzu nebude potřeba žádná speciální příprava vzorku a vzorek lze použít i pro jiná vyšetření. Pro tuto studii bude použit mikroskop InVia Raman od společnosti RENISHAW UK. Intenzita laseru 488nm bude použita po dobu 10 sekund. RMS bude provedena na 6 různých místech a při studiu se použije průměrná hodnota.